譚會(huì)潔，宋俊科，石 峰，張 雯，杜冠華，郭常川

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

帕金森病(parkinson’s disease，PD)是第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，帕金森病的主要病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡并且殘存胞漿中形成路易小體[1-2]。尋找安全有效的藥物以防止多巴胺能神經(jīng)元變性死亡對(duì)于PD治療具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素(isorhamnetin，ISO)具有明確的內(nèi)皮保護(hù)作用、能夠抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌纖維化、抗血小板凝集、抗氧化等[3-5]。然而，異鼠李素對(duì)神經(jīng)退行性疾病損傷模型中細(xì)胞保護(hù)作用及分子機(jī)制尚未完全清楚。

環(huán)腺苷酸反應(yīng)結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是通過自身磷酸化實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子。CREB能夠被多種激酶激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[6-7]。磷酸肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路與帕金森病聯(lián)系密切，在介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元存活中起重要作用。Phospho-Akt觸發(fā)下游靶標(biāo)磷酸化，導(dǎo)致糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)和促凋亡B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族失活，進(jìn)一步激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白[8-9]。

異鼠李素能否通過PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號(hào)通路抑制魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性損傷未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立魚藤酮損傷PC12細(xì)胞模型，探討異鼠李素是否能夠通過PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號(hào)通路抑制多巴胺能神經(jīng)元損傷。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12購(gòu)自吉妮歐生物有限公司。異鼠李素(R018214)購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養(yǎng)基(31870082)、胎牛血清(10100147)、馬血清(26050088)均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。魚藤酮(R8875)、LY294002(L9908)、氮乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC，A7250)、MTT(M2128)均購(gòu)自Sigma-Aldrich；乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit，C0016)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。CREB(sc-377154)、p-CREB(sc-81486)抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。Akt(4685)、p-Akt(4060)、GSK3β(12456)、p-GSK3β(5558)和GAPDH(5174)抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology。電泳儀(PowerPac Basic)、成像儀(Molecular Imager ChemiDoc XRS+System)，美國(guó)Bio-Rad；酶標(biāo)儀(SpectraMax M5)，美國(guó)Molecular Devices。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，其中含有10%馬血清和5%胎牛血清，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔一天換液，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，接種于不同培養(yǎng)板中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn)分為七組：(1)空白對(duì)照組；(2)ISO對(duì)照組，加入15 μmol·L-1ISO；(3)魚藤酮損傷組，加入10 μmol·L-1魚藤酮損傷24 h；(4)ISO低劑量組，在給予魚藤酮損傷之前，加入1.5 μmol·L-1ISO預(yù)孵育2 h；(5)ISO中劑量組，在給予魚藤酮損傷之前，加入5 μmol·L-1ISO預(yù)孵育2 h；(6)ISO高劑量組，在給予魚藤酮損傷之前，加入15 μmol·L-1ISO預(yù)孵育2 h；(7)NAC陽(yáng)性對(duì)照組，在給予魚藤酮損傷之前，加入5 mmol·L-1NAC預(yù)孵育2 h。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率將PC12細(xì)胞接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，棄培養(yǎng)液，加入MTT工作溶液100 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄MTT溶液，加入DMSO 100 μL，結(jié)晶溶解后測(cè)定吸光度。

1.5 LDH釋放率檢測(cè)將PC12細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置空白對(duì)照組、樣品對(duì)照組、樣品最大酶活性組、藥物處理組。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前1 h，在樣品最大酶活性組中加入LDH釋放劑10 μL，繼續(xù)孵育1 h后取每孔120 μL上清液，進(jìn)行測(cè)定。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)將PC12細(xì)胞接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，PBS洗一次，加入200 μL預(yù)冷的蛋白裂解液30 min后提取細(xì)胞總蛋白。加入5×loading buffer后沸水浴10 min，之后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。然后5% BSA室溫封閉2 h再分別用稀釋后的CREB、p-CREB、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β和GAPDH抗體孵育4 ℃過夜。TBST洗滌3次，置于對(duì)應(yīng)二抗中孵育2 h，最終TBST洗滌3次后成像。

2 結(jié)果

2.1 ISO減輕魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷MTT檢測(cè)結(jié)果如Fig 1A所示，與空白對(duì)照組相比，15 μmol·L-1ISO單獨(dú)孵育PC12細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞活力沒有明顯影響。與空白對(duì)照組相比，10 μmol·L-1魚藤酮處理PC12細(xì)胞后，細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，ISO 1.5，5和15 μmol·L-1及5 mmol·L-1NAC均能明顯提高PC12細(xì)胞存活率(P<0.05或P<0.01)。LDH檢測(cè)結(jié)果如Fig 1B所示，與空白對(duì)照組相比，ISO對(duì)照組PC12細(xì)胞LDH釋放量無(wú)明顯變化，魚藤酮損傷組PC12細(xì)胞LDH釋放量明顯增加(P<0.01)，5和15 μmol·L-1ISO及5 mmol·L-1NAC均能明顯抑制魚藤酮誘增的LDH釋放(P<0.05或P<0.01)。

A: The cell viability was determined using MTT assay;B: The LDH release was detected by the LDH Cytotoxicity Assay Kit.##P<0.01vssham group,*P<0.05,**P<0.01vsrotenone group.

2.2 ISO提高魚藤酮損傷PC12細(xì)胞中CREB的磷酸化水平Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，魚藤酮損傷PC12細(xì)胞模型組p-CREB/CREB比值明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01)。與魚藤酮損傷組相比，1.5 μmol·L-1ISO預(yù)處理對(duì)p-CREB/CREB比值無(wú)明顯影響，5和15 μmol·L-1ISO預(yù)處理組p-CREB/CREB比值明顯提高(P<0.01)。結(jié)果如Fig 2。

Fig 2 Phosphorylation of CREB in PC12 cells

A: The expression of p-CREB and CREB were detected by Western blot. GAPDH was used as a loading control; B: p-CREB/CREB ratio.##P<0.01vsControl group,**P<0.01vsrotenone group.

2.3 ISO增加魚藤酮損傷的PC12細(xì)胞中Akt和GSK-3β的磷酸化水平采用Western blot檢測(cè)魚藤酮損傷PC12細(xì)胞后，p-Akt/Akt比值和p-GSK-3β/GSK-3β比值變化。與空白對(duì)照組相比，魚藤酮損傷組PC12細(xì)胞中p-Akt/Akt比值和p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯降低(P<0.01)。然而，與魚藤酮損傷組相比，5和15 μmol·L-1ISO預(yù)處理不同程度增強(qiáng)了p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果如Fig 3。

2.4 ISO對(duì)魚藤酮損傷PC12細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響為進(jìn)一步明確ISO對(duì)魚藤酮損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用是否通過PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，并且PI3K/Akt/GSK-3β通路的激活是否有助于CREB的磷酸化。加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002預(yù)處理PC12細(xì)胞。如Fig 4所示，與空白對(duì)照相比，魚藤酮損傷模型組PC12細(xì)胞后Akt，GSK-3β，CREB的磷酸化水平明顯降低，PC12細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)。與魚藤酮損傷組相比，ISO預(yù)處理組可以增強(qiáng)p-Akt，p-GSK-3β，p-CREB的表達(dá)，提高細(xì)胞活力(P<0.01)。加入LY294002后能夠部分阻斷ISO引起的p-Akt，p-GSK-3β，p-CREB的表達(dá)增加，抑制細(xì)胞活力增強(qiáng)(P<0.05)。

Fig 3 Levels of p-Akt and p-GSK-3β elevatedby

A:The levels of p-Akt,Akt,p-GSK-3β and GSK-3β were detected by Western blot. GAPDH was used as a loading control;B:p-Akt/Akt and p-GSK-3β/GSK-3β ratio.##P<0.01vscontrol group,*P<0.05,**P<0.01vsrotenone group.

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ISO預(yù)處理能夠激活CREB，增加Akt和GSK-3β磷酸化，發(fā)揮PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，免受魚藤酮毒性導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002，能夠抑制CREB和Akt的磷酸化，激活GSK-3β，最終部分阻斷ISO對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。

魚藤酮是植物毛魚藤的有效成分，對(duì)中樞多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)有選擇性損傷，長(zhǎng)期接觸可引起多巴胺神經(jīng)退行性病變[2]。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，能夠合成多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)，含有合成、分解多巴胺所需要的酶。本實(shí)驗(yàn)以魚藤酮損傷構(gòu)建PD細(xì)胞模型，探討異鼠李素對(duì)魚藤酮損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，應(yīng)用PI3K抑制劑處理PC12細(xì)胞，觀察CREB磷酸化程度，闡明CREB對(duì)異鼠李素調(diào)控PC12細(xì)胞的作用機(jī)制。

CREB是一種普遍存在的磷酸化依賴性轉(zhuǎn)錄因子，可以通過各種絲氨酸/蘇氨酸激酶在Ser133進(jìn)行磷酸化而被激活。CREB的激活是多種適應(yīng)性變化的基礎(chǔ)，能增強(qiáng)cAMP誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，魚藤酮抑制CREB的磷酸化，而ISO預(yù)處理能夠促進(jìn)CREB的活化，提高魚藤酮損傷PC12細(xì)胞的活力。GSK-3β是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)的蛋白激酶，參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞程序性死亡等多種細(xì)胞過程。文獻(xiàn)報(bào)道抑制GSK-3β活化可以減少細(xì)胞凋亡提高細(xì)胞存活[10-11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，魚滕酮損傷PC12細(xì)胞中GSK-3β被激活，但I(xiàn)SO預(yù)處理能夠抑制GSK-3β活性，降低魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞毒性作用。

Fig 4 Effects of ISO on activation of CREB and cell viability in presence of PI3K

A:The levels of p-Akt,Akt,p-GSK-3β,GSK-3β,p-CREB and CREB were detected by Western blot. GAPDH was used as a loading control;B:p-Akt/Akt,p-GSK-3β/GSK-3β and p-CREB/CREB ratio; C: The protective effect of ISO on rotenone-induced PC12 cells was reversed by LY294002.##P<0.01vscontrol group,*P<0.05,**P<0.01vsrotenone group,△P<0.05vsISO group.

GSK-3β能夠被多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞存活，PI3K/Akt是其中最重要的上游調(diào)節(jié)通路。研究表明PI3K/Akt通路的激活在預(yù)防細(xì)胞變性和細(xì)胞凋亡中起主導(dǎo)作用[8,12-13]。在外源性和內(nèi)源性應(yīng)激、胰島素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的刺激下，Akt磷酸化一系列下游靶標(biāo)，使GSK-3β磷酸化和失活，激活CREB。不同神經(jīng)毒素誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷后，Akt ser473的活化受到明顯抑制，磷酸化水平明顯降低，GSK3β ser9失活也明顯受抑制。我們的實(shí)驗(yàn)顯示了類似的結(jié)果，魚藤酮損傷可降低Akt活性，激活GSK-3β，同時(shí)降低CREB磷酸化。目前，PI3K/Akt/GSK-3β途徑是研究細(xì)胞凋亡的重要通路。激活GSK-3β可能參與缺血再灌注后的神經(jīng)保護(hù)。麥角黃毒素通過下調(diào)p-GSK3β和p-Akt水平，抑制6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步加入PI3K抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)ISO激活CREB，Akt，使GSK-3β失活，以上結(jié)果證實(shí)PI3K/Akt/GSK-3β/CREB的激活參與了ISO的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，ISO預(yù)處理可以減輕魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用，其神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過激活PI3K/Akt/GSK-3β/CREB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。