馬曉嬌，承歐梅，校 歡，宋 丹，蔣青松，邱紅梅

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

急性腦缺血疾病因其極高的致殘率和死亡率，且多數(shù)幸存者通常伴有學(xué)習(xí)和記憶缺陷、認(rèn)知功能障礙等后遺癥，為患者及其家屬帶來巨大壓力[1]。因此，改善腦缺血后遺癥，尤其是認(rèn)知功能障礙是此類疾病治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，大腦在缺血損傷后會(huì)進(jìn)行自身修復(fù)，神經(jīng)發(fā)生則在自身修復(fù)中發(fā)揮著尤為關(guān)鍵的作用，也已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。

神經(jīng)發(fā)生主要是神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)在一定條件下增殖、分化、遷移、整合，并恢復(fù)神經(jīng)功能的過程[2]。最初認(rèn)為神經(jīng)發(fā)生僅在哺乳動(dòng)物的胚胎期，而成年腦組織神經(jīng)元是不再進(jìn)行增生和分化的終極細(xì)胞[3]。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的兩個(gè)區(qū)域也同樣存在內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生：側(cè)腦室的室管膜下(subventricularzone，SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus，DG)的顆粒細(xì)胞下層(subgranularzone，SGZ)[4]。但由于腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞數(shù)量較少，且存活率較低，缺血后的組織重構(gòu)和功能恢復(fù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，因此，神經(jīng)學(xué)一直致力于尋找有效的治療方法和藥物靶點(diǎn)，刺激內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，更好地恢復(fù)患者的大腦功能。

經(jīng)顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation，tDCS)是一種運(yùn)用恒直弱電流(一般小于2 mA)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)的物理治療方式[5]，它通過微弱的直流電作用于大腦皮質(zhì)，改變神經(jīng)元膜電位的電荷分布，產(chǎn)生去極化或超極化現(xiàn)象，從而起到改變大腦皮質(zhì)的興奮性，調(diào)控大腦功能的作用[6]。目前，臨床上tDCS多用于輔助康復(fù)治療，如腦卒中患者運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中tDCS多用于改善阿爾茲海默癥模型鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。對(duì)tDCS是否能夠影響小鼠急性腦缺血后海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生研究較少。

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體參與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育，在學(xué)習(xí)和記憶功能的發(fā)育中尤為重要[7]。NMDA受體的亞基NR2a和NR2b在海馬和大腦皮層中高度表達(dá)，參與神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育過程，如細(xì)胞遷移、促進(jìn)神經(jīng)元軸突和樹突的生成、激活突觸重建，影響神經(jīng)發(fā)生恢復(fù)腦功能。那么，tDCS能否通過促進(jìn)腦缺血小鼠海馬內(nèi)源性海馬神經(jīng)發(fā)生，改善學(xué)習(xí)記憶功能，該作用是否與其增強(qiáng)NMDA受體功能有關(guān)？因此，本研究擬采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉法(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)建立小鼠急性腦缺血模型，探索tDCS對(duì)急性腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生的促進(jìn)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU，批號(hào)：HMBF8725V，純度99%)；大鼠抗BrdU單克隆抗體、兔抗DCX單克隆抗體、兔抗NeuN單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Dy Light488標(biāo)記山羊抗兔IgG、Dy Light549標(biāo)記山羊抗大鼠IgG購(gòu)自美國(guó)abbkine公司；兔抗β-actin、NR2b多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司；兔抗NR2a單克隆抗體購(gòu)自上海傲圖公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器 Morris水迷宮(深圳瑞沃德公司)；光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)；激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國(guó))；定量PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))；Denley Dragon Wellscan MK3酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)雄性成年健康C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(24±2)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2018-0003。120只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)，tDCS低、高劑量組(tDCS75和150 μA，即tDCSL和tDCSH組)，每組30只。其中Morris水迷宮每組隨機(jī)選擇6只，HE染色、免疫熒光染色、qRT-PCR、Western blot每組各4只。

1.2.2動(dòng)物模型的制備[8]小鼠記錄體質(zhì)量后3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部皮膚用酒精仔細(xì)消毒后沿著正中剪開，暴露氣管，用玻璃分針從氣管兩側(cè)鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，注意避免傷及迷走神經(jīng)，動(dòng)脈夾閉20 min后恢復(fù)血供，縫合傷口，Sham組僅分離雙側(cè)頸部總動(dòng)脈不進(jìn)行夾閉。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥 如Fig 1所示，對(duì)小鼠進(jìn)行電極的安裝并給予恢復(fù)期，用牙科水泥將陽極電極，即填充了棉花和銅線的內(nèi)徑為2 mm的塑料管(接觸面積為3.14 mm2)，固定在右側(cè)額葉區(qū)(前鹵+2 mm，矢狀縫+1.5 mm)，陰極參考電極(接觸面積為5 cm2)通過粘性電極片固定于小鼠胸腹部，每次刺激開始前將電極用生理鹽水潤(rùn)濕以降低電刺激阻抗。造模24 h后給予相應(yīng)強(qiáng)度的tDCS，每天30 min，重復(fù)5 d后,間隔2 d，再次給予tDCS，每天30 min，重復(fù)5 d，總計(jì)10 d[9]。Sham組與Model組給予假刺激，即只連通電路不給予電流刺激。免疫熒光組小鼠在造模d 9～13各組給予腹腔注射BrdU(50 mg·kg-1)，每天1次，持續(xù)5 d。

Fig 1 Schematic diagram of mouse tDCS installation

A：Location of stimulation electrode (anode) in mouse brain; B：Electrode configurations in mice. The anodal electrode was installed onto the skull above the right frontal cortex,while the cathodal electrode was placed onto the ventralthorax.

1.2.4行為學(xué)測(cè)試[10]造模后d 28，每組6只小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，在前5 d的定位航行實(shí)驗(yàn)中，每天進(jìn)行4次試驗(yàn)，在每次試驗(yàn)期間，四組小鼠分別從四個(gè)象限面向池壁放入水中，給予60 s尋找水下隱藏的平臺(tái)并記錄找到的時(shí)間，60 s內(nèi)未找到的小鼠記為60 s并進(jìn)行引導(dǎo)；d 6的探索實(shí)驗(yàn)中，移去平臺(tái)，記錄60s小鼠穿越虛擬平臺(tái)的次數(shù)。通過頂置相機(jī)和行為跟蹤軟件記錄小鼠的移動(dòng)。

1.2.5HE染色 造模后d 7，每組4只小鼠心臟灌注后進(jìn)行取腦，腦組織用多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋后再(前囟3.3～4.5 mm)連續(xù)切片，片厚5 μm，用于HE染色[2]。顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件計(jì)算正常神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.6BrdU免疫熒光 造模后d 14，每組4只小鼠心臟灌注后取腦，腦組織用多聚甲醛固定，蔗糖溶液梯度脫水后，再用冰凍切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，片厚10 μm。切片甲酰胺修復(fù)、鹽酸變性、硼酸中和、Triton-x破膜、山羊血清封閉后加BrdU(1 ∶200)一抗過夜，暗室內(nèi)加DyLight 594標(biāo)記羊抗大鼠熒光二抗(1 ∶200)、DAPI染色后甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬DG區(qū)BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.7DCX免疫熒光 造模后d 14，每組4只小鼠，按照前述BrdU免疫熒光的方法取材后獲得冰凍切片。切片冷丙酮固定、檸檬酸修復(fù)、Triton-x破膜、山羊血清封閉后加DCX(1 ∶200)一抗過夜。暗室內(nèi)加DyLight 488標(biāo)記羊抗兔熒光二抗(1 ∶200)、DAPI染色后甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬DG區(qū)DCX蛋白陽性表達(dá)并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.8BrdU/NeuN免疫熒光 造模后d 28，每組4只小鼠，按照前述BrdU免疫熒光的方法取材后獲得冰凍切片。切片甲酰胺修復(fù)、鹽酸變性、硼酸中和、Triton-x破膜、山羊血清封閉后加BrdU/NeuN(1 ∶200)一抗過夜。暗室內(nèi)加DyLight 594標(biāo)記羊抗大鼠和DyLight 488標(biāo)記羊抗兔熒光二抗(1 ∶200)、DAPI染色后甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬DG區(qū)BrdU/NeuN陽性細(xì)胞表達(dá)并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.9逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)海馬NR2a、NR2b的mRNA表達(dá) 造模d 14，每組4只小鼠麻醉后斷頭取腦，冰上迅速分離雙側(cè)海馬組織，保存于液氮中，按照說明書提取海馬RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以β-actin為內(nèi)參，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增進(jìn)行反應(yīng)，引物序列如表1所示。記錄循環(huán)閾值(Ct值)作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，mRNA的表達(dá)水平用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

Tab 1 Sequences of primers (5' to 3')

1.2.10Western blot檢測(cè)海馬NR2a、NR2b的蛋白表達(dá) 造模后d 14，每組4只小鼠麻醉后斷頭取腦，冰上迅速分離雙側(cè)海馬組織，保存于液氮中。提取蛋白后BCA法測(cè)定總蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠：電泳、轉(zhuǎn)印等步驟后[2]，加一抗β-actin(1 ∶2 000)、NR2a(1 ∶1 000)、NR2b(1 ∶1 000)，4 ℃過夜；洗膜，加二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育2 h，洗膜后加ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用Image Lab 4.1進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 tDCS對(duì)腦缺血小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響如Fig 2所示，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠的平臺(tái)潛伏期均逐漸縮短。與Sham組相比，Model組小鼠從d 2起尋臺(tái)潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；與Model組相比，tDCS高刺激治療組小鼠尋臺(tái)潛伏期顯著縮短(P<0.01)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與Sham組相比，Model組小鼠跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與Model組相比，tDCS低刺激組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異；tDCS高刺激組顯著增加小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)(P<0.01)。

Fig 2 Effect of tDCS on learning and memory functions after cerebral ischemia in

A：Escape latency time;B：The frequency of crossing the platform.**P<0.01vssham;##P<0.01vsmodel

2.2 tDCS對(duì)腦缺血小鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)的影響如Fig 3的HE染色所示，Sham組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，飽滿，呈圓形，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，染色呈藍(lán)色；而Model組神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，破碎，不規(guī)則，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目相比Sham組顯著減少(P<0.01)。tDCS治療后神經(jīng)元形態(tài)得到改善，與Model組相比，tDCS低刺激組差異無顯著性；tDCS高刺激組正常神經(jīng)元數(shù)目明顯增加(P<0.01)。

2.3 tDCS對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生的影響如Fig 4A、B所示，與Sham組相比，Model組小鼠海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加(P<0.01)；給予tDCS治療后，兩個(gè)刺激組陽性細(xì)胞數(shù)均在Model組基礎(chǔ)上明顯增加(P<0.01)。如Fig 4C、D所示，與Sham組相比，Model組小鼠海馬齒狀回DCX蛋白陽性表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與Model組相比，給予tDCS低刺激后，陽性表達(dá)在Model組基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加(P<0.05)；給予tDCS高刺激后，陽性表達(dá)明顯增加(P<0.01)。如Fig 4E、F所示，與Sham組相比，Model組小鼠海馬齒狀回BrdU/NeuN陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加(P<0.01)；給予tDCS治療后，兩個(gè)刺激組陽性細(xì)胞數(shù)均在Model組基礎(chǔ)上明顯增加(P<0.01)。

Fig 3 Effect of tDCS on pathological changes in hippocampus CA1 region of cerebral ischemia

A:Pathological changes in hippocampal CA1 region (×400);B:The count of CA1 neurons in hippocampus.**P<0.01vssham;##P<0.01vsmodel

2.4 tDCS對(duì)腦缺血后海馬NR2a、NR2b水平的影響如Fig 5所示，與Sham組相比，Model組小鼠NR2a的mRNA表達(dá)(P<0.05)和蛋白表達(dá)(P<0.01)均明顯增加；在給予tDCS低刺激后，NR2a的mRNA表達(dá)在Model組基礎(chǔ)上進(jìn)一步增加(P<0.05)，而蛋白表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)；在給予tDCS高刺激后，NR2a的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)相比于Model組均明顯增加(P<0.01)。與Sham組相比，Model組小鼠NR2b的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；給予tDCS治療后，高刺激組NR2b的mRNA和蛋白表達(dá)均在Model組基礎(chǔ)上明顯增加(P<0.01)。

3 討論

腦缺血性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病[11]。隨著醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，急性腦缺血的治療逐漸取得巨大成果，但缺血性認(rèn)知功能障礙，尤其是學(xué)習(xí)記憶功能障礙的治療問題仍需攻克。目前認(rèn)為，腦缺血導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，主要原因在于海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，而這種功能障礙恢復(fù)不良可能與缺乏足夠的新生神經(jīng)元相關(guān)。神經(jīng)發(fā)生是腦缺血后的自身修復(fù)，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞被激活后發(fā)育成熟并替補(bǔ)受損神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，增加內(nèi)源性神經(jīng)元數(shù)目，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生可能是認(rèn)知功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素之一。本研究采用小鼠急性腦缺血模型，模擬急性腦缺血病的病理生理進(jìn)程，研究腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生及tDCS的促進(jìn)作用及可能機(jī)制。

隨著物理因子治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的安全有效性逐步提高，tDCS作為一種無創(chuàng)口、安全性高、適應(yīng)癥廣泛，通過在靶部位施加微弱電流調(diào)節(jié)大腦功能的治療方式，在近些年逐漸成為研究熱點(diǎn)。tDCS在治療帕金森等神經(jīng)和精神疾病展示出了極好的發(fā)展前景，但其是否對(duì)急性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生有促進(jìn)作用及其機(jī)制還尚不清楚。應(yīng)用不同強(qiáng)度的tDCS刺激缺血后小鼠，通過觀察各項(xiàng)指標(biāo)，以期證明tDCS可顯著促進(jìn)缺血后小鼠的內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生以及腦功能恢復(fù)。

研究證實(shí)腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在9～13 d為增殖高峰，28 d后分化為成熟神經(jīng)元[12]。BrdU作為一種核苷酸類似物，具有比核苷酸更好的親和力，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)替代核苷酸插入DNA鏈中，因此，可以通過外源性注射BrdU觀察神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況；DCX在腦生長(zhǎng)發(fā)育中至關(guān)重要，在遷移和分化的神經(jīng)元軸突上持續(xù)表達(dá)，常用來研究神經(jīng)元前體細(xì)胞的遷移和分化[13]；神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN特異性標(biāo)記成熟神經(jīng)元，BrdU/NeuN雙標(biāo)普遍用于標(biāo)記新生的成熟的神經(jīng)元。本研究中，腦缺血小鼠海馬HE染色顯示CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核不規(guī)則，呈固縮狀態(tài)，排列紊亂，結(jié)構(gòu)不完整，數(shù)目明顯減少；Morris水迷宮尋臺(tái)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿越虛擬平臺(tái)次數(shù)明顯減少，這些結(jié)果提示腦缺血導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡，且學(xué)習(xí)記憶功能顯著下降；同時(shí)，腦缺血小鼠的海馬齒狀回BrdU、DCX、BrdU/NeuN的陽性細(xì)胞表達(dá)均明顯增加，提示NSC被激活增殖、分化、遷移并發(fā)育為成熟神經(jīng)元，腦缺血后海馬區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生，但結(jié)合Morris水迷宮結(jié)果提示雖然缺血后機(jī)體出現(xiàn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生以進(jìn)行自我修復(fù)，但遠(yuǎn)不足以改善缺血后認(rèn)知功能的恢復(fù)。給予150 μA刺激強(qiáng)度的tDCS治療可明顯增加正常神經(jīng)元數(shù)量，縮短尋臺(tái)時(shí)間，增加穿臺(tái)次數(shù)，這些結(jié)果提示高刺激強(qiáng)度的tDCS治療可明顯改善CA1區(qū)神經(jīng)元病理損害并提高學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知能力；同時(shí)，BrdU、DCX和BrdU/NeuN陽性細(xì)胞數(shù)在Model組基礎(chǔ)上進(jìn)一步顯著增加，內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生明顯增強(qiáng)，提示tDCS治療可能通過進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，從而恢復(fù)缺血后腦功能重建。

Fig 4 Effect of tDCS on hippocampal neurogenesis in cerebral

A:BrdU positive cells in the hippocampal dentate gyrus(100×); B: The count of BrdU positive cells;C:DCX positive cells in the hippocampal dentate gyrus(100×); D: The count of DCX positive cells; E:BrdU/NeuN positive cells in the hippocampal dentate gyrus(100×); F: The count of BrdU/NeuN positive cells.**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 5 Effect of tDCS on mRNA and protein expression of NR2a and NR2b in hippocampus of cerebral ischemia

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

成年海馬神經(jīng)發(fā)生受到網(wǎng)狀多靶點(diǎn)調(diào)控，其中NMDA亞基NR2a和NR2b參與突觸可塑性及記憶形成過程，在神經(jīng)元發(fā)育過程中的樹突狀分支中起重要作用，從而發(fā)揮介導(dǎo)海馬神經(jīng)生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果顯示，無論是模型組小鼠還是給予tDCS治療后的腦缺血小鼠其增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生作用均與NR2a和NR2b表達(dá)上調(diào)相關(guān)，提示NR2a和NR2b表達(dá)上調(diào)參與了缺血后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生過程，而tDCS可通過進(jìn)一步提高其表達(dá)，促進(jìn)缺血后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

綜上所述，tDCS可促進(jìn)急性腦缺血后小鼠內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，從而改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙，其機(jī)制可能與促進(jìn)NR2a和NR2b表達(dá)上調(diào)有關(guān)。由于急性腦缺血參與因素的復(fù)雜性和tDCS作用的廣泛性，tDCS對(duì)急性腦缺血后小鼠的保護(hù)作用的參與機(jī)制仍需要進(jìn)行更深入的研究。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝！)