陳端凱，馮 時，唐乾利，姜 艷，2，唐 強，岑小寧，黃漢基，尹 星

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣西 南寧 530001)

慢性難愈合創(chuàng)面是指創(chuàng)面皮膚在一個月內(nèi)無法實現(xiàn)皮膚的完整性，且炎癥反應(yīng)和組織損傷不斷增加的創(chuàng)面[1]。本病發(fā)病率高，常影響患者的生活質(zhì)量，給其帶來巨大的心理及經(jīng)濟負擔。目前臨床針對慢性難愈合創(chuàng)面的治療方法各式各樣，但療效均具有局限性。因此，人們都嘗試以濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment，MEBT/MEBO)治療慢性難愈合創(chuàng)面。

徐榮祥教授發(fā)明的MEBT/MEBO應(yīng)用于燒傷創(chuàng)面，主要是將濕潤暴露療法與濕潤燒傷膏的有機結(jié)合[2]，且臨床療效明顯。唐乾利教授研究團隊[3-4]將該技術(shù)拓展應(yīng)用于慢性難愈合皮膚潰瘍創(chuàng)面，并進行了一系列臨床與基礎(chǔ)研究，取得了較好的研究成果，但具體作用機制仍然不甚明了，仍待進一步探索。已有研究表明：細胞外基質(zhì)(ECM)表達的變化在慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)方面具有一定的作用效果[5]，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可參與ECM的降解與重塑[6]，其中基質(zhì)金屬蛋白酶2( MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9( MMP-9)能夠通過降解ECM，進而來參與ECM重塑的調(diào)節(jié)。但MEBT/MEBO是否通過影響慢性難愈合創(chuàng)面組織中 MMP-2和 MMP-9的表達來促進創(chuàng)面愈合？尚未得到證實。

有鑒于此，本研究將通過構(gòu)建大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型，觀察大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-2和 MMP-9的動態(tài)表達，以及MEBT/MEBO的影響效果，進而闡明 MMP-2和 MMP-9在創(chuàng)面修復(fù)中的具體作用，并完善MEBT/MEBO的部分作用機制，為臨床推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級Wistar成年大鼠【長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2014.0011】，♂，12周齡，體質(zhì)量(235±15)g。

1.1.2儀器與試劑 Western blot全套系統(tǒng)(美國BIO-RAD)；超微量紫外分光光度計(德國Backman)；酶標儀(美國賽默飛)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國Roche)；4 ℃離心機(德國Eppendorf)；顯微鏡(日本Olympus)。美寶濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，國藥準字Z20000004)；貝復(fù)新(珠海億勝生物制藥有限公司，國藥準字S20040001)；醋酸氫化可的松(上海通用藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H31021290)； MMP-2和 MMP-9一抗(美國Novus)；二抗(北京索萊寶)； MMP-2、 MMP-9和GAPDH引物(上海生工)；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、熒光試劑盒(北京天根)； MMP-2、 MMP-9 ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型的建立 將90只SPF級♂ Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按數(shù)字表法隨機分為5組：MEBO組、貝復(fù)新組、慢性組、急性組及空白組，每組18只。經(jīng)10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，對5組大鼠均進行備皮。除急性組和空白組外，其余3組大鼠均參照付小兵等全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環(huán)肉芽腫定量法經(jīng)改進制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型[7-8]。在大鼠靠近脊柱處剪切15 mm圓形全層皮膚開放性創(chuàng)口，隨后敷蓋消毒干紗布，并膠條固定。再對MEBO組、貝復(fù)新組和模型組腹腔注射醋酸氫化可的松[8 mg·(100 g)-1]處理，建立成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。急性組以同樣的方法進行剪切皮膚包扎處理，但是不注射醋酸氫化可的松?？瞻捉M只需進行備皮處理，而沒有做任何創(chuàng)面損傷處理。

1.2.2治療方法 造模成功后，隨后進行早晚各一次的常規(guī)消毒和換藥處理，直至取材完成。換藥方法如下：MEBO組在創(chuàng)面均勻涂抹MEBO藥膏(約1.0 mm厚)后，再在傷口敷蓋浸有MEBO藥膏的紗布塊[0.2 g·(cm2)-1]；貝復(fù)新組在創(chuàng)面涂抹貝復(fù)新[262.5 U·(cm2)-1]后，再在創(chuàng)面敷蓋浸有貝復(fù)新的紗布塊[60.0 U·(cm2)-1]；急性組和慢性組只需將浸有生理鹽水的紗布塊敷蓋于創(chuàng)面上。包扎前均加蓋兩層干紗布，膠條“豐”型固定。

1.2.3實驗標本采集 造模后，分別于d 3、14每組各隨機處死9只大鼠，剪取相同部位從深筋膜下層切取距離創(chuàng)緣0.5 cm的整個創(chuàng)面及周圍組織的肉芽組織，一部分儲存于-80 ℃冰箱，待進行蛋白及基因檢測，另一部分則放在10%甲醛中進行固定，待后期行病理切片觀察。

1.3 檢測方法

1.3.1創(chuàng)面愈合情況 于造模d 3、14，對傷口大小進行透明薄膜覆蓋描畫及拍照記錄。并利用Image J軟件對創(chuàng)面進行分析處理，創(chuàng)面愈合率計算公式：創(chuàng)面愈合率/%=[(原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積]×100%。創(chuàng)面愈合時間則以創(chuàng)面?zhèn)谕耆掀せ癁闃藴蔬M行計算。

1.3.2HE染色 取創(chuàng)面組織后，進行固定脫水包埋切片等操作。再行常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3ELISA MMP-2和MMP-9的檢測方法均按照ELISA試劑盒操作說明書進行操作，檢測各組織勻漿中 MMP-2和 MMP-9蛋白表達情況。

1.3.4Western blot技術(shù) 取標本后，提取蛋白，檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；室溫搖床封閉1 h；清洗(均用TBST清洗3次，每次6 min，下同)；4 ℃一抗搖床孵育過夜；清洗；室溫二抗孵育1 h；清洗；洗膜結(jié)束后進行發(fā)光顯影。最后利用Image J軟件進行灰度分析處理。

1.3.5qRT-PCR 按照試劑盒操作說明書進行提取RNA和逆轉(zhuǎn)錄處理，再以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行擴增檢測目的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。再將檢測到的CT值，用相對定量2-ΔΔCt法進行分析處理。見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 MEBO對大鼠大體情況的影響造模d 2，慢性組大鼠死亡2只，補同批次大鼠2只，其他各組均無死亡情況。余下老鼠情況良好，能夠正常自主飲食飲水。

造模d 3，滲液、水腫情況：急性組、MEBO組和貝復(fù)新組輕于慢性組；肉芽組織生長情況：急性組、MEBO組和貝復(fù)新組可見肉芽組織的存在，而慢性組則較少見。見Fig 1。

Fig 1 General situation of wound healing

A: Acute wound group; B: Chronic wound group;C: rb-bFGF group; D: MEBO group.1: d 3; 2: d 14.

造模d 14，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組創(chuàng)緣長出毛發(fā)，創(chuàng)口干燥，且均長出痂皮；而慢性組創(chuàng)口可見色澤暗紅、壞死、紅腫及滲液滲出。

2.2 MEBO對大鼠創(chuàng)面愈合時間及愈合率的影響急性組、MEBO組和貝復(fù)新組創(chuàng)面愈合時間明顯短于慢性組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見Fig 2。

與慢性組相比，造模d 3，急性組創(chuàng)面愈合率增高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MEBO組和貝復(fù)新組也增高，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；而d 14，創(chuàng)面愈合率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見Fig 3。

Fig 2 Wound healing in each

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group;3: rb-bFGF group; 4: MEBO group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 3 Wound healing rate in each group

*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

2.3 MEBO對大鼠創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)變化的影響空白組是正常皮膚，故可見正常的皮膚附件存在，整齊排列的膠原纖維及少量成纖維細胞。

造模d 3，炎性細胞浸潤情況：各組均可見大量炎性細胞的浸潤；間質(zhì)水腫情況：慢性組間質(zhì)水腫情況較急性組、MEBO組和貝復(fù)新組嚴重；新生毛細血管情況：急性組、MEBO組和貝復(fù)新組可見排列紊亂的毛細血管分布，而慢性組稀少。

d 14，炎性細胞浸潤情況：除慢性組外，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組幾乎不見炎性細胞的浸潤。膠原纖維情況：急性組、MEBO組和貝復(fù)新組可見到排列整齊的膠原纖維，而慢性組則排列紊亂；皮膚附件生長情況：除慢性組外，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組均可見正常皮膚附件生長。見Fig 4。

Fig 4 Changes of wound tissue morphology of rats in each group at each time point(HE,×200)

A: Acute wound group; B: Chronic wound group; C: rb-bFGF group; D: MEBO group; E: Blank group.1: d 3; 2: d 14

2.4 MEBO對大鼠創(chuàng)面組織勻漿中 MMP-2和 MMP-9表達的影響通過ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):空白組MMP-2和 MMP-9低表達。與慢性組比較，d 3創(chuàng)面組織中，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組均增高，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而d 14，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組MMP-2和MMP-9表達也均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，(見Fig 5，6)。

2.5 MEBO對大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-2和 MMP-9蛋白表達情況的影響空白組幾乎不表達 MMP-2和MMP-9。與慢性組相比，d 3創(chuàng)面組織中，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組中 MMP-2和 MMP-9的蛋白表達量增高(均P<0.05)；d 14，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組中 MMP-2和 MMP-9的蛋白表達量均降低(均P<0.05)，(見Fig 7，8)。

Fig 5 Protein expression of MMP-2 in homogenate

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 6 Protein expression of MMP-9 in homogenate

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

2.6 MEBO對大鼠創(chuàng)面組織中 MMP-2和 MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響空白組幾乎不轉(zhuǎn)錄 MMP-2 mRNA和 MMP-9 mRNA。與慢性組相比，d 3創(chuàng)面組織中，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組中 MMP-2 mRNA和 MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；在d 14，急性組、MEBO組和貝復(fù)新組中 MMP-2 mRNA和 MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，(見Fig 9，10)。

Fig 7 Protein expression of MMP-2

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 8 Protein expression of MMP-9

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group;4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

3 討論

慢性難愈合創(chuàng)面快速增長的發(fā)病率正在威脅著臨床醫(yī)生，其不愈合傷口的增長速度遠遠快于有效新療法的出現(xiàn)，故尋求有效治療慢性難愈合創(chuàng)面的新方法迫在眉睫。本研究通過探討MEBT/MEBO對慢性難愈合創(chuàng)面組織中 MMP-2和 MMP-9表達的影響，并進一步探討MEBT/MEBO可能作用機制，為臨床治療慢性難愈合創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

Fig 9 mRNA expression of MMP-2 in each

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 10 mRNA expression of MMP-9 in each

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

MMP-2和 MMP-9具有降解ECM蛋白并激活細胞因子、趨化因子的功能，故常參與皮膚傷口愈合的過程，如炎癥，基質(zhì)重塑和上皮的形成。而ECM是廣泛的分布于各細胞之間，參與關(guān)鍵細胞的調(diào)節(jié)作用，如細胞的黏附、遷移、增殖、分化和存活。在正常生理情況下，ECM的穩(wěn)態(tài)平衡是確保正常器官發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，而 MMP-2和 MMP-9參與這一穩(wěn)態(tài)平衡的維持。已有多項研究證明，當出現(xiàn)基質(zhì)異常沉積時， MMP-2和 MMP-9的表達量就會升高，以降解ECM的含量，來保證穩(wěn)態(tài)的平衡[5,6,9-11]。因此， MMP-2和 MMP-9在創(chuàng)面愈合中作用不容小覷。

本研究結(jié)果顯示，急性組中 MMP-2和 MMP-9的表達呈先升高后降低的趨勢，而慢性組中 MMP-2和 MMP-9表達的升高呈明顯的時間依賴性，然而在d 14慢性組表達明顯高于急性組。在正常皮膚中能夠少量表達 MMP-2，而幾乎不表達 MMP-9。慢性創(chuàng)口在早期炎癥階段狀態(tài)下，就出現(xiàn)了修復(fù)的停滯；而急性組能夠進行正常修復(fù)的主要原因是由于它能夠及時的通過炎癥階段這一進程，進入增殖與重塑階段。此次實驗通過建立大鼠創(chuàng)面模型，發(fā)現(xiàn)了慢性創(chuàng)面與急性創(chuàng)面的愈合差異可能與 MMP-2和 MMP-9表達變化相關(guān)。既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性創(chuàng)面早期 MMP-2和 MMP-9表達升高，但是后期將恢復(fù)到基礎(chǔ)水平；而在炎癥持續(xù)的情況下，慢性創(chuàng)面組織中的 MMP-2和 MMP-9表達持續(xù)上升并在后期高于急性創(chuàng)面組織的表達，進而導(dǎo)致創(chuàng)面發(fā)生延遲愈合。本研究結(jié)果與既往發(fā)現(xiàn)相契合[12-13]。

同時，在研究過程中發(fā)現(xiàn)：MEBO組和貝復(fù)新組中 MMP-2和 MMP-9的表達與慢性組之間的差異是隨時間的變化發(fā)生改變的；在創(chuàng)傷的早期，MEBO組和貝復(fù)新組中的 MMP-2和 MMP-9的表達量是高于慢性組的，而后期則低于慢性組的表達，且我們通過創(chuàng)面愈合率與創(chuàng)面愈合時間的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，MEBO組和貝復(fù)新組的創(chuàng)面愈合情況較慢性組好，提示：MEBO組和貝復(fù)新組可能通過調(diào)控 MMP-2和 MMP-9的表達來促進創(chuàng)面愈合的。

創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵在于血管新生為創(chuàng)面提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)[14]。血管新生的關(guān)鍵在于血管發(fā)生側(cè)支生芽，而生芽的關(guān)鍵在于血管基底膜的降解， MMP-2和 MMP-9在其中發(fā)揮著重要的作用，本研究HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期高表達 MMP-2和 MMP-9的急性組、MEBO組和貝復(fù)新組能夠觀察到大量的毛細血管新生，提示MMP-2和 MMP-9促進創(chuàng)面愈合可能是通過降解ECM，進而促進血管新生。這與既往研究結(jié)果一致，MMP-2和 MMP-9能夠降解ECM，調(diào)節(jié)著ECM的穩(wěn)態(tài)平衡，進而促進創(chuàng)面的愈合[9,15]。

綜上，本研究結(jié)果表明 ，MMP-2和MMP-9與創(chuàng)面愈合結(jié)局密切相關(guān)，MEBT/MEBO可能通過調(diào)控慢性難愈合創(chuàng)面組織中 MMP-2和 MMP-9表達來影響創(chuàng)面的愈合，這為臨床治療慢性難愈合創(chuàng)面提供了更價廉、效優(yōu)的治療方法。全面了解 MMP-2和 MMP-9的調(diào)節(jié)，對創(chuàng)面修復(fù)和患者預(yù)后有著重要的作用，我們在研究中雖證實MEBT/MEBO能夠調(diào)控慢性創(chuàng)面組織中 MMP-2和 MMP-9的表達，但是MEBT/MEBO是否可通過調(diào)控 MMP-2和 MMP-9來影響慢性創(chuàng)面組織中ECM表達尚屬未知，故仍需進行體內(nèi)外 MMP-2和 MMP-9基因位點敲除實驗，進一步闡述其具體機制。