■祝新茗 趙 靜 夏長革 李沐陽 劉洪健 王桂芹*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院動物生產(chǎn)與質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合實驗室，吉林長春130118；3.吉林省長春市新立城水庫管理局，吉林長春130119；4.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，吉林長春130012）

烏鱧(Channa argus)是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類[1]。在集約化養(yǎng)殖環(huán)境下，烏鱧對各種病原體的易感性增加[2]，導致流行魚病多發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟損失。為使死亡率降低，抗生素及免疫增強劑已用于預防或治療養(yǎng)殖魚類疾病[3]。然而，使用抗生素作為預防措施，除了會影響魚類產(chǎn)品的安全性外，還會造成環(huán)境污染且會誘導產(chǎn)生耐藥菌群[4]。免疫增強劑可以增強魚類的疾病抵抗能力，促進魚類固有免疫功能，增強魚類適應性免疫能力[5]。因此，開發(fā)綠色經(jīng)濟的免疫增強劑，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。目前廣泛應用的免疫增強劑包括益生菌[6]、維生素E[7]、大黃素[8]、殼聚糖[9]、蝦青素[10]、多糖[11]和黃酮[12]等，在這些免疫增強劑中，植物提取物具有來源廣泛、生物可降解、無耐藥性、性價比高、環(huán)境友好等諸多優(yōu)點[11]。

沙蔥（Allium mongolicum Regel），百合科（Lilia?ceae Juss），蔥屬（Alliaceae）[13]。生長于高海拔沙漠地區(qū)和荒漠草原，風味獨特，營養(yǎng)價值高，富含脂肪、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖、黃酮等多種營養(yǎng)成分[14]。作為一種野生蔬菜，沙蔥及其提取物在促生長[14]、抗氧化[13]以及抗炎[15]等方面具有一定作用。黃酮類化合物是天然藥物中重要的活性成分，在機體抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等方面效果較為顯著。目前許多植物黃酮已被用作免疫增強劑來提高機體抗氧化、抗炎能力，促進機體免疫應答，其中大豆異黃酮、淫羊藿黃酮、芒果葉黃酮、山核桃葉黃酮、棗葉黃酮等在水產(chǎn)動物上已有研究。研究表明，大豆異黃酮可以加快魚類生長，提高免疫、抗氧化及抗病能力[16]。棗葉黃酮在斑馬魚體內(nèi)有良好的抗氧化能力，且對其體內(nèi)自由基具有良好的清除作用[17]。山核桃葉黃酮可以抑制斑馬魚體內(nèi)凋亡基因的異常表達，降低活性氧（ROS）水平[18]。沙蔥黃酮可以提高綿羊外周血淋巴細胞增殖率[15]，加速肉羊生長，促進其生長相關激素分泌[14]。

淋巴細胞（Lymphocyte）是機體淋巴器官產(chǎn)生的白細胞，參與機體特異性免疫反應，在機體免疫應答中起主要作用。而魚類淋巴細胞是數(shù)量最多的一類白細胞，是魚類免疫學研究的重要內(nèi)容[19]。本研究旨在研究沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞活性、抗氧化能力及炎癥相關基因相對表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 沙蔥黃酮的制備

本試驗采用超聲提取法提取所需沙蔥黃酮[14]，提取時間為15 min，溫度40 ℃，所用乙醇濃度為75%，料液比1∶30。預計黃酮產(chǎn)量為12.85 mg/g 沙蔥粉。使用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，將沙蔥黃酮配制為不同濃度的儲存液，使用前用RPMI-1640培養(yǎng)液進行稀釋。

1.2 試驗魚的飼養(yǎng)

試驗所用烏鱧[（體質(zhì)量（50±0.12）g/尾]購自遼寧劉二堡漁場，暫養(yǎng)于室內(nèi)200 L水族箱中，馴化15 d，試驗溫度(26±2) ℃；pH值(7.1±0.1)；氨氮含量＜0.02 mg/l；亞硝酸鹽含量＜0.05 mg/l，溶解氧＞5.0 mg/l，每日飽食投喂兩次（8:00、16:00），每2 d更換半箱水。取樣前停食24 h，使用MS-222（200 mg/l）進行麻醉，隨機抽取5尾魚，通過尾靜脈穿刺取血，而后立即轉(zhuǎn)移到無菌封頂預冷（4 ℃）抗凝管（氯化鈉415 mmol/l、檸檬酸鈉30 mmol/l、葡萄糖100 mmol/l、檸檬酸26 mmol/l、乙二胺四乙酸30 mmol/l，pH值4.6）中。

1.3 烏鱧血淋巴細胞的分離培養(yǎng)

烏鱧血淋巴細胞的分離參照謝昆等[20]的方法。將抽取的血液與磷酸緩沖鹽溶液（PBS）以1∶2 比例混合稀釋，將稀釋后的血液平鋪在淋巴細胞分離劑（北京索萊寶科技有限公司）表面，600×g離心20 min，小心吸取淋巴細胞層，加入等量的RPMI-1640 液，600×g離心20 min；棄掉上清液，以上述方法離心2次，棄上清液，獲得細胞沉淀，通過血細胞計數(shù)器測定細胞數(shù)。將細胞放入含有20%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素（北京索萊寶科技有限公司）的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前測定培養(yǎng)基中活細胞數(shù)量（臺盼藍染色法），調(diào)整至活細胞密度為1×106個/ml。

在細胞懸液中加1%的沙蔥黃酮稀釋液，調(diào)整沙蔥黃酮濃度分別為0（對照）、25、50、100、200 μg/ml，將調(diào)整好的細胞懸液加入96 孔板中，每孔加入3 ml細胞懸液，每組5個重復。置于27 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后198×g 離心5 min。收集細胞液氮速凍后在-80 ℃下儲存以測量抗氧化參數(shù)及相對基因表達。

1.4 烏鱧血淋巴細胞活性測定

采用MTT 法對烏鱧血淋巴細胞活性進行測定，對照組和添加組每孔分別抽取100 μl細胞液轉(zhuǎn)入96孔U 型細胞培養(yǎng)板中，每孔加入10 μg/l Con A 100 μl，在27 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至20 h 時，每孔加入5 mg/ml 噻唑藍（MTT）20 μl，再放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，培養(yǎng)結(jié)束后600×g離心10 min，棄上清液，每孔加入100 μl 二甲基亞砜，震蕩10 min，570 nm 處測定各孔吸光度值。

1.5 抗氧化指標測定

總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）等抗氧化指標的測定嚴格按照南京建成生物工程研究所提供試劑盒說明進行操作。

1.6 熒光定量PCR測定

收集每組培養(yǎng)基中懸浮細胞，采用TRIzol試劑盒法（大連Takara 公司）提取總RNA，使用NanoDrop 2000 分光光度法（Thermo scientific，USA）分析RNA濃度及質(zhì)量，按照TRIzol 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒法（大連Ta?kara 公司）法將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin 為內(nèi)參基因，使用Takara Premix Ex TaqTM П熒光定量試劑盒進行測定，引物序列見表1。PCR 反應體系 包 括SYBR qPCR Mix（10 μl），上游和下游引物（10 mmol/l，1 μl），cDNA（1 μl），ddH2O（7 μl）。PCR 反應條件為預變性（95 ℃、30 s）；40 個循環(huán)（95 ℃、5 s；60 ℃、30 s）。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計分析

試驗所得Ct 值采用2?ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。試驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，采用Tukey 多重比較分析組間差異顯著性，若P＜0.05 則表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞活性的影響(見表2)

表2 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞活性的影響

如表2 所示，與對照組相比，隨著沙蔥黃酮濃度的增加，烏鱧血淋巴細胞活性呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)24 h后，各添加組血淋巴細胞活性均顯著高于對照組（P＜0.05），其中100 μg/ml 處理組血淋巴細胞活性最高。

2.2 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞抗氧化能力的影響(見表3)

由表3 可知，隨著沙蔥黃酮劑量的增加，烏鱧血淋巴細胞T-AOC、NO、CAT、T-SOD及GSH-Px水平都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，MDA 含量呈現(xiàn)與之相反的趨勢。50、100、200 μg/ml 添加組T-AOC、NO 水平顯著高于對照組（P＜0.05），其余添加組與對照組無顯著差異（P＞0.05）；100、200 μg/ml 添加組CAT 水平顯著高于對照組（P＜0.05），其余添加組CAT水平與對照組無顯著差異（P＞0.05）；所有添加組T-SOD、GSH-Px水平均顯著高于對照組（P＜0.05）；100 μg/ml 添加組MDA 含量顯著低于對照組（P＜0.05），其余添加組MDA水平低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞抗氧化指標的影響

2.3 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞基因相對表達量的影響(見表4)

如表4 可知，沙蔥黃酮促進烏鱧血淋巴細胞HSP70、HSP90、IκBα、GR 基因的表達，抑制IL-1、TNF-α、IL-8、NF-κB p65 基因的表達。隨著沙蔥黃酮濃度的升高，HSP70、HSP90、IκBα、GR 相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，IL-1、IL-8、TNFα、NF-κB p65 的相對表達量則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。100 μg/ml 添加組IL-1、TNF-α相對表達量顯著低于對照組（P＜0.05）；50、100、200 μg/ml 添加組NF-κB p65 相對表達量顯著低于對照組（P＜0.05）；所有添加組IL-8 相對表達量均顯著低于對照組（P＜0.05）。50、100、200 μg/ml 添加組GR 相對表達量顯著高于對照組（P＜0.05）；100 μg/ml 添加組HSP70、HSP90、IκBα相對表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。

表4 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞基因相對表達量的影響

3 討論

3.1 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞活性的影響

淋巴細胞是一種重要的白細胞，其細胞活性的高低可以在一定程度上反映機體的免疫水平。研究表明香菇多糖、靈芝多糖、枸杞多糖可有效提高黃顙魚免疫細胞活性[21-23]；金蕎麥根提取物可提高雞脾淋巴細胞活性[24]；滸苔多糖能使小鼠淋巴細胞活性提高[25]；苜蓿多糖可促進小鼠淋巴細胞增殖[26]；沙蔥黃酮能夠促進肉羊外周血淋巴細胞增殖[15]等。與上述研究結(jié)果相似，本試驗中100 μg/ml 沙蔥黃酮添加組烏鱧血淋巴細胞活性最強，其余各組均顯著高于對照組。

3.2 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞抗氧化能力的影響

抗氧化是抗氧化自由基的簡稱，機體受到外界刺激，體內(nèi)會產(chǎn)生大量的自由基，過量的自由基會使細胞代謝紊亂，從而威脅養(yǎng)殖動物的健康。T-SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px 是抗氧化系統(tǒng)中的最主要的酶，能夠有效清除自由基；NO是由一氧化氮合酶催化精氨酸產(chǎn)生的氣體信號分子，具有廣譜殺菌性，一定程度的NO 可以反映機體固有免疫情況。MDA 是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，過量產(chǎn)生會破壞細胞膜完整性被破壞、使細胞發(fā)生突變、對抗氧化防御系統(tǒng)造成損傷。有報道稱，黃芪多糖可以提高雜交鱧抗氧化能力[27]；大豆異黃酮可以使大鼠體內(nèi)抗氧化能力得到提高[28]；蘆葦黃酮類提取物可以增強大鼠血清中GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量[29]；沙蔥黃酮可以降低山羊紅細胞中MDA含量，提高T-SOD、CAT、GSH-Px水平[30]，也可以使小鼠血清和肝臟中抗氧化酶類的含量和活性升高，MDA 含量下降[31]。本試驗結(jié)果表示，在一定劑量范圍內(nèi)，沙蔥黃酮可以提高烏鱧血淋巴細胞中T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px 以及NO 的水平，抑制MDA的生成，提高細胞抗氧化活性，這與以上報道所得結(jié)論一致。

3.3 沙蔥黃酮對烏鱧血淋巴細胞基因相對表達量的影響

NF-κB是主要的促炎轉(zhuǎn)錄因子，它可被炎性細胞因子、氧化應激物、病毒和細菌產(chǎn)物等多種細胞外信號激活[32]。IL-1、IL-8 和TNF-α是有效的促炎因子，通過調(diào)節(jié)其他細胞因子的表達進而誘導炎癥反應。GR 是核激素受體轉(zhuǎn)錄因子[33]。GR 可與NF-κB 信號通路相互作用共同影響炎癥基因的表達水平[34]。熱休克蛋白（HSP）是一類伴侶蛋白，包括HSP70 和HSP90，在GR 蛋白復合物形成過程中起重要作用[35]。研究表明，可可黃酮會下調(diào)NF-κB信號通路中炎癥因子的表達[36]；韓國薊馬齒黃酮具有良好的抗炎作用[37]；中草藥提取物可以上調(diào)團頭魴體內(nèi)HSP70 的表達水平[38]。蒲黃總黃酮能使Ⅱ型糖尿病大鼠血漿IL-6 水平降低[39]。穗花杉雙黃酮可減少急性肝損傷大鼠體內(nèi)炎癥細胞因子的釋放[40]。染料木黃酮可抑制脂肪細胞NF-κB 通路的激活[41]。藍莓葉總黃酮通過影響炎癥相關因子表達，從而減輕炎癥反應[42]。Chen等[43]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加谷氨酰胺可以顯著提高鯉魚幼魚GR 表達及HSP70 水平。本試驗結(jié)果表明，不同濃度沙蔥黃酮可提高烏鱧血淋巴細胞HSP70、HSP90、GR、IκBα基因的表達，抑制IL-1、IL-8、TNF-α、NFκB p65 基因的表達，這與上述研究結(jié)果基本一致，這證明沙蔥黃酮可以調(diào)節(jié)機體免疫應答以及免疫相關基因的表達。

4 結(jié)論

綜上所述，100～200 μg/ml 沙蔥黃酮在一定程度上能夠有效提高烏鱧血淋巴細胞活性、抗氧化能力、調(diào)節(jié)機體免疫應答以及免疫相關基因的表達。