■羅飛亞 楊慧超 劉夢(mèng)婷 曾建國(guó)，3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸藥湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128）

谷物在貯存過(guò)程中容易發(fā)生腐爛酸敗現(xiàn)象，尤其是一些油脂類成分含量高的產(chǎn)品，這就給企業(yè)甚至國(guó)家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。變質(zhì)的谷物不僅會(huì)導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)成分的損失，而且會(huì)危害人類健康。而谷物在貯存過(guò)程中腐爛酸敗多是由于物理、化學(xué)及微生物影響所致，其中微生物的影響最為明顯[1]。吳國(guó)鋒[2]指出我國(guó)小麥粉主要是由芽孢菌群、大腸菌群等微生物影響，其中細(xì)菌量的典型數(shù)值為104CFU/g，大腸菌群典型數(shù)值為102CFU/g，芽孢菌總數(shù)的典型數(shù)值為103CFU/g。井勇[3]報(bào)道谷物霉變主要是由于曲霉菌屬引起。一直以來(lái)，人們?yōu)榱私鉀Q谷物在貯存過(guò)程中腐爛酸敗的問(wèn)題，長(zhǎng)期的做法是添加防腐劑、防蟲劑等[4]，而此類物質(zhì)多是化學(xué)物質(zhì)，具有一定毒性，對(duì)人類的健康存在著極大的安全隱患。因此，尋找一種新型的防霉防腐劑和抗氧化劑來(lái)解決谷物在貯存過(guò)程發(fā)生的腐爛酸敗問(wèn)題顯得尤為重要。

植物精油是從芳香植物中提取的一類天然物質(zhì)，我國(guó)植物資源豐富，為開發(fā)利用植物精油提供了有利條件。植物精油成分復(fù)雜，多由幾十至上百種化合物組成，大都具有特殊香味，并具有一定的抗菌和抗氧化能力[5]，因此廣泛受到人們的關(guān)注。王放銀等[6]研究表明石香薷精油對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抑制效果；張有林等[7]研究百里香精油的抗菌及抗氧化活性，結(jié)果顯示百里香精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉菌、啤酒酵母菌的抗菌性均表現(xiàn)為敏感型，且其具有較強(qiáng)的抗氧化能力；柴向華等[8]研究表明羅勒精油對(duì)霉菌有較好的抑制作用；賈佳等[9]通過(guò)肉湯稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法研究迷迭香精油的抑菌活性，結(jié)果表明迷迭香精油具有廣譜抗菌作用。王新偉等[10]研究表明牛至油對(duì)面包酵母和黑曲霉菌有較好的抑制作用。而目前對(duì)精油的研究大都集中在單一品種的抗菌和抗氧化，缺少對(duì)多種植物精油的比較研究，對(duì)精油植物資源的研究開發(fā)帶來(lái)不便。本文選取了五種植物精油并研究其抗菌、抗氧化作用，為更好地將植物精油開發(fā)成新型的防霉防腐劑提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

電子調(diào)溫電熱套（98-1-B型，天津市泰斯特儀器有限公司）；PL203 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；UV2400型紫外可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（NanoQuant in?finite M200Pro TECAN）；ZHWY-103D 型臺(tái)式恒溫振蕩器（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（北京市永安光明醫(yī)療儀器廠）；LDZF-75KB-Ⅱ型立體蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 材料

藥材：石香薷（Mosla chinensis Maxim.，湖南新寧）、迷迭香（Rosmarinus officinalis Linn.，湖南長(zhǎng)沙）、牛至（Origanum vulgare Linn.，湖南長(zhǎng)沙）、百里香（Thymus mongolicus Ronn.，山東青島）、羅勒（Oci?mum basilicum Linn.，山東青島）。

試劑：DPPH(50 mg/瓶)、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(FRAP 法，碧云天生物技術(shù))、吐溫-80、無(wú)水硫酸鈉(分析純，500 g/瓶)、沒(méi)食子酸丙酯（PG，化學(xué)純，100 g/瓶)、抗壞血酸（VC，1 g/瓶，阿拉?。?、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDA），水為蒸餾水，tryptone、yeast ex?tract（OXOID），氯化鈉(分析純)、瓊脂粉。

菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli, E.Coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.a)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis, S.e)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis, B.s)，黑曲霉菌（Aspergillus Niger），所有供試菌種均來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

2 方法

2.1 植物精油的提取

參考王書平等[11]方法。將五種藥材切斷至1 cm左右，分別取200 g于圓底燒瓶中，加水1 200～1 600 ml，使水剛好浸沒(méi)藥材為宜，震蕩搖勻后，靜置30 min，然后連接揮發(fā)油測(cè)定器和冷凝回流管。從冷凝回流管上端加水至揮發(fā)油測(cè)定器刻度線，并出現(xiàn)水流入圓底燒瓶的現(xiàn)象為止。然后用電熱套加熱至沸騰，并保持微沸4 h，停止加熱。靜置片刻后，打開揮發(fā)油提取器下端活塞，收集精油，用無(wú)水硫酸鈉除水后置于棕色瓶中，4 ℃保存?zhèn)溆茫⒂?jì)算各藥材的提取率。

2.2 植物精油的抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 植物精油對(duì)DPPH·的清除率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.019 7 g DPPH·溶解于無(wú)水乙醇中，定容于250 ml 棕色容量瓶中，即配制成2×10-4mol/l的DPPH·乙醇溶液，低溫儲(chǔ)藏備用；另取適量精油用無(wú)水乙醇溶解，分別配制成1、5、10、20、40、80 μg/ml的精油乙醇溶液，低溫儲(chǔ)藏備用。

參照Kaan 等[12]和Thaipong 等[13]的方法。吸取2 ml 2×10-4mol/l 的DPPH·乙醇溶液，再加入2 ml 無(wú)水乙醇，置于具塞試管中，記作A0；另取兩根具塞試管各加入2 ml 1 μg/ml 的精油溶液，然后分別加入2 ml 2×10-4mol/l 的DPPH·乙醇溶液、2 ml 無(wú)水乙醇溶液，分別記作Ai和Aj。用力搖勻。將A0、Ai和Aj所表示的樣品在室溫暗處?kù)o置反應(yīng)30 min，加入比色皿中，在波長(zhǎng)517 nm 處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，以無(wú)水乙醇作為對(duì)照調(diào)零，分別測(cè)出A0、Ai和Aj所示樣品的吸光度值。同理分別測(cè)定出5、10、20、40、80 μg/ml的精油溶液的吸光度值，并用PG和VC做陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)濃度重復(fù)3次，記錄平均值。植物精油對(duì)DPPH·的清除率（SR%）按下面公式計(jì)算。

2.2.2 植物精油總抗氧化能力的測(cè)定（FRAP法）

集控臺(tái)上和機(jī)旁控制面板上均設(shè)有車鐘顯示板，用于使機(jī)旁試車工作人員及時(shí)掌握主機(jī)的運(yùn)行狀態(tài)(車令復(fù)示功能)和與集控臺(tái)操作人員的通信(輔車鐘通信功能)。

參照陳玉霞等[14]方法。96 孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180 μl FRAP工作液，空白對(duì)照孔中加入5 μl蒸餾水，樣品檢測(cè)孔內(nèi)分別加入5 μl 不同體積分?jǐn)?shù)的精油溶液。以Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。37 ℃孵育3～5 min在593 nm 處測(cè)定其吸光度。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的總抗氧化能力以FRAP 值來(lái)表示，1 FRAP 值與1 mmol/l FeSO4相當(dāng)。圖1 為FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得其回歸方程為Y=0.306x+0.052 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 1。

圖1 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 植物精油的抑菌圈測(cè)定

采用濾紙片擴(kuò)散法[15]，在無(wú)菌條件下，吸取2 μl精油于濾紙片（d=6 mm）上，并使其完全均勻分散，自然風(fēng)干，貼到涂抹適宜濃度菌懸液（1×106～107CFU/ml）的培養(yǎng)基平板上，每皿2 片并以無(wú)菌水作對(duì)照，重復(fù)3 次，37 ℃培養(yǎng)12 h，十字交叉法[16]測(cè)定抑菌圈大小。

2.4 植物精油最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用二倍稀釋法[17-18]，并稍作改變。將五種精油分別用1%的吐溫-80 水溶液稀釋成160 μl/ml 的溶液。取無(wú)菌試管10支，排成一排，編號(hào)1～10。除1號(hào)管中加入1.6 ml LB 培養(yǎng)基，其余各管各加入1 ml LB 培養(yǎng)基。然后再加入0.4 ml 精油溶液至1 號(hào)管，混勻，從1 號(hào)管中吸取1 ml 液體加入至2 號(hào)管，混勻后吸取1 ml 加入3 號(hào)管，以此類推，8 號(hào)管中吸取1 ml 液體棄去。9 號(hào)管為不含精油溶液的生長(zhǎng)對(duì)照，10 號(hào)管為空白對(duì)照。然后在1～8 號(hào)每管內(nèi)加入菌液1 ml，使精油濃度最終為0.125～16 μl/ml，最終菌液濃度為1×106～107CFU/ml。將接種好的試管，于37 ℃培養(yǎng)6 h，然后吸取100 μl 涂布瓊脂平板，再于37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的為最低抑菌濃度（MIC），在此基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng)12 h，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的為最低殺菌濃度（MBC）。

2.5 植物精油對(duì)真菌的抑制作用測(cè)定

參考馬萱等[19]的方法。挑取適量黑曲霉菌孢子，接種在PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，倒入5 ml無(wú)菌水，輕輕洗下孢子，制成孢子懸浮液，使孢子濃度大約在1×104個(gè)/ml。然后用移液槍取100 μl的孢子懸浮液加到已制好的PDA平板上，用滅菌的涂布棒涂勻，將含有2 μl 精油的濾紙片放在培養(yǎng)皿中心，重復(fù)3次，以不加濾紙片作為生長(zhǎng)對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)一周，觀察并記錄霉菌生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)果

3.1 植物精油的提取結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物精油的提取率（v/m）隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，在蒸餾4 h 后進(jìn)而達(dá)到飽和。石香薷精油的提取率為1.73%，迷迭香精油的提取率為1.90%，百里香精油的提取率為0.75%，牛至精油提取率為0.30%，羅勒精油的提取率為0.13%。

3.2 DPPH·清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

五種植物精油清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，五種植物精油對(duì)DPPH·的清除率大小與其濃度呈正向相關(guān)。石香薷精油的IC50=1.92 μg/ml，迷迭香精油的IC50=20.36 μg/ml，羅勒精油的IC50＜1 μg/ml，百里香精油的IC50＜1.42 μg/ml，牛至精油的IC50＜1.47 μg/ml?？傮w來(lái)看，五種植物精油表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。百里香精油對(duì)DPPH·的IC50值稍小于牛至精油，但牛至精油在達(dá)到飽和點(diǎn)的清除率卻稍大于百里香精油，說(shuō)明牛至精油清除DPPH·的能力要略強(qiáng)于百里香精油，而抗氧化劑表現(xiàn)出來(lái)的抗氧化活性大小一般是酚類＞醛類＞醇類，本研究中所選五種植物精油其化學(xué)成分都含有大量的酚類以及烯烴類化合物，如百里香酚、對(duì)傘花烴、香芹酚等[20-24]，因此其具有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

圖2 五種植物精油對(duì)DPPH·的清除率

3.3 總抗氧化能力結(jié)果分析

由圖1 可知，F(xiàn)eSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.15～1.5 mmol/l之間線性關(guān)系良好。圖3 為五種精油溶液的FRAP值測(cè)定結(jié)果?？梢钥闯?，五種植物精油的總抗氧化能力大小為羅勒精油＞牛至精油＞石香薷精油＞百里香精油＞迷迭香精油，羅勒精油的抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他四種精油，迷迭香精油的總抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他四種精油。同理測(cè)得對(duì)照組Trolox 的相對(duì)總抗氧化能力為2.03±0.11，與其比較而言，本實(shí)驗(yàn)研究的五種植物精油都具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖3 五種精油的FRAP值

3.4 植物精油的抑菌活性結(jié)果分析

3.4.1 植物精油的抑菌活性(見表1)

如表1所示，五種植物精油對(duì)四種病原菌都展現(xiàn)出了抑制作用，其中石香薷精油、百里香精油、牛至精油對(duì)S.a 抑制作用較強(qiáng)，而其對(duì)E.Coli、B.s、S.e 的抑菌效果相當(dāng)。迷迭香精油對(duì)四種病原菌的抑制效果都較差，羅勒精油對(duì)S.a的抑制作用一般，但仍要強(qiáng)于其對(duì)E.Coli、B.s、S.e的抑制作用。

3.4.2 植物精油的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果

采用肉湯稀釋法測(cè)定了五種植物精油的MIC 和MBC，植物精油對(duì)四種病原菌的MIC 和MBC 見表2。石香薷精油對(duì)S.a、B.s、S.e的MIC值為1 μl/ml，MBC值分別為2、1、2 μl/ml，對(duì)E.coli 的MIC 值為2 μl/ml，MBC 為4 μl/ml，顯示了石香薷精油具有較強(qiáng)的抑菌和殺菌能力。同樣牛至精油和百里香油也具有良好的抑菌能力，MIC 在1～4 μl/ml 之間。而迷迭香精油和羅勒精油的抑菌能力就顯得較弱，這也與抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性，其對(duì)四種病原菌的MBC 值更是達(dá)到了16 μl/ml，但迷迭香精油對(duì)S.e 的MIC 和MBC值一樣，都為4 μl/ml。

表1 五種植物精油對(duì)不同菌種的抑菌圈的影響(mm)

表2 植物精油對(duì)四種病原菌的MIC和MBC(μl/ml)

3.4.3 植物精油對(duì)黑曲霉菌的抑制結(jié)果分析(見表3)

由表3 可知，其中石香薷精油組在培養(yǎng)前3 d 都無(wú)霉菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第4 d 開始有少量霉菌生長(zhǎng)，至第7 d 大量生長(zhǎng)至一皿；百里香精油組在第3 d 開始有霉菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)第5 d 霉菌開始大量生長(zhǎng)；而牛至精油是在培養(yǎng)第2 d 開始有霉菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第5 d有霉菌大量生長(zhǎng)?？梢钥闯霰狙芯恐?，石香薷精油對(duì)霉菌抑制效果最好，其次是百里香精油、牛至精油，而迷迭香精油和羅勒精油對(duì)霉菌幾乎沒(méi)有抑制作用。

表3 植物精油對(duì)黑曲霉菌的抑制作用

4 討論

我國(guó)芳香植物資源豐富，在植物精油的原料選擇方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究中石香薷、迷迭香、百里香等植物精油的提取率較高，分別達(dá)到了1.73%、1.90%、0.75%。選擇精油提取率較高的植物開發(fā)利用，可以極大的節(jié)約成本。

本研究通過(guò)DPPH·清除實(shí)驗(yàn)和FRAP 法測(cè)定了五種精油的抗氧化能力，結(jié)果顯示五種植物精油對(duì)DPPH·都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的清除能力，其中羅勒精油清除DPPH·的能力最強(qiáng)，IC50＜1 μg/ml，而石香薷精油、百里香精油、牛至精油的IC50值相當(dāng)，迷迭香的IC50值高于其他四種精油。另外，五種植物精油的總抗氧化能力也和清除DPPH·的能力表現(xiàn)出一致性，羅勒精油的總抗氧化能力最強(qiáng)，其FRAP值達(dá)到了1 536.67，相比之下迷迭香精油的總抗氧化能力很低，其FRAP 值只有22.14，與報(bào)道相差較大[26]，可能是由于地域原因?qū)е戮椭杏行Щ瘜W(xué)成分含量不同，從而影響其清除自由基的能力。

本研究中五種植物精油在抑制微生物生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出不同的能力，其中石香薷精油、百里香精油、牛至油展現(xiàn)出了廣譜抗菌作用，不僅對(duì)實(shí)驗(yàn)中四種供試細(xì)菌有較好的抑制效果，而且對(duì)黑曲霉菌也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用，尤其對(duì)S.a 的抑制作用最為明顯（抑菌圈大于30 mm）。相比之下，迷迭香精油對(duì)四種供試細(xì)菌的抑菌能力較弱，羅勒精油對(duì)S.a 有較明顯的抑制作用，但其殺菌濃度較高，而羅勒精油和迷迭香精油對(duì)黑曲霉菌都沒(méi)有抑制作用。

植物精油可作為一種新型的天然、綠色、無(wú)毒的防霉防腐劑開發(fā)應(yīng)用，前景廣闊。本研究表明石香薷精油、百里香精油、牛至精油具有良好的抗菌抗氧化作用，而羅勒精油具有極強(qiáng)的抗氧化能力，但其抗菌作用略弱，后期考慮復(fù)配精油進(jìn)行深入研究。同時(shí)希望通過(guò)更深入的研究挖掘出更多芳香植物精油[27-28]，以便在將來(lái)替代化學(xué)類防霉防腐劑應(yīng)用于生活的各個(gè)領(lǐng)域。