王東月 綜述 李運清 審校

(1濟寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濟寧 272013；2濟寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟寧 272067)

念珠菌屬是人體皮膚黏膜的正常寄生菌，也是臨床上重要的條件致病性真菌，通常存在于人的口腔、上呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道中[1]。在機體功能正常的情況下，念珠菌不會對機體產(chǎn)生不利影響；當(dāng)機體免疫力低下或者內(nèi)環(huán)境中發(fā)生菌群失調(diào)時，念珠菌可以進(jìn)行大量繁殖，過度生長的念珠菌將導(dǎo)致宿主相關(guān)功能受損并發(fā)生條件致病性感染。在念珠菌的所有致病物種中，白色念珠菌是念珠菌屬的主要的致病菌，該菌引起的感染占臨床機會致病性真菌感染的70%～90%[2]。它可引起宿主機體發(fā)生多種感染，主要包括侵犯皮膚、黏膜和指(趾)甲的淺部念珠菌病和累及內(nèi)臟系統(tǒng)甚至播散至全身而引起的深部念珠菌病，對人們的身體健康產(chǎn)生巨大的威脅。近年來，由于免疫缺陷患者的增多，免疫抑制類藥物的使用，導(dǎo)致臨床上白色念珠菌感染者越來越多，逐漸引起人們的重視[3]。

絲狀真菌可以通過極性化生長和側(cè)向分枝生長形成菌絲，菌絲的形成可以幫助細(xì)胞完成侵襲和定植，以獲得更多的營養(yǎng)物質(zhì)，并有助于尋找交配伴侶和宿主細(xì)胞，以進(jìn)行進(jìn)一步的生長繁殖。白色念珠菌是一種二相性真菌，可以在酵母形態(tài)和菌絲形態(tài)之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)換，具有菌絲形態(tài)的細(xì)胞致病能力比無菌絲形態(tài)的細(xì)胞致病能力強[4]。

1 白色念珠菌的菌絲及其在致病性中的作用

白色念珠菌是一種二相性真菌，其形態(tài)能夠在單細(xì)胞的酵母型(卵圓形)、假菌絲(在隔膜處有狹窄的細(xì)長的細(xì)胞鏈)和真菌絲(細(xì)胞像管道一樣，具有平行壁，在隔膜處沒有縊縮，通過連續(xù)的頂端延伸和隔膜生長)之間進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化，這個過程被稱為二型性轉(zhuǎn)換[5]。白色念珠菌的二型性轉(zhuǎn)換能力在其發(fā)揮致病作用過程中是必需的。

白色念珠菌一般以酵母形態(tài)存在于機體內(nèi)，當(dāng)機體的免疫功能受到抑制，或者發(fā)生微生態(tài)失衡時，白色念珠菌可轉(zhuǎn)變其生長狀態(tài)，由酵母型轉(zhuǎn)變?yōu)榫z型，其感染性增強，進(jìn)而對機體產(chǎn)生危害[6-8]。

白色念珠菌的發(fā)育及形態(tài)的轉(zhuǎn)化可以通過改變外部條件進(jìn)行調(diào)控。該調(diào)控是通過可調(diào)節(jié)的四環(huán)素啟動子啟動NRG1基因(菌絲形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子)的表達(dá)來實現(xiàn)的，而菌絲形成是導(dǎo)致感染發(fā)生的主要原因，酵母型細(xì)胞對機體組織的毒力較低，但仍然保留著它的致病潛能，一旦轉(zhuǎn)換為菌絲則致病能力增強，進(jìn)而引起組織感染，因此，形態(tài)轉(zhuǎn)換在白色念珠菌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[9-10]。

在感染的各個時期，白色念珠菌的酵母型和菌絲型細(xì)胞都能被觀察到，而菌絲型細(xì)胞在感染過程的早期階段(即粘附和傳播)中發(fā)揮顯著作用[11]。有實驗室采用含有純合缺失突變的白色念珠菌菌株感染內(nèi)皮細(xì)胞，選擇的絲狀結(jié)構(gòu)調(diào)控基因分別為CLA4、CPH1、EFG1和TUP1。野生型菌株在內(nèi)皮細(xì)胞上能形成真正的菌絲，但efg1Δ和cph1Δ efg1Δ突變體只能以酵母形態(tài)存在，不能形成菌絲，tup1Δ突變體能夠形成假菌絲，但喪失了形成真正的菌絲的能力。efg1Δ、cph1Δ efg1Δ和tup1Δ這三株突變體對內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲和損傷能力顯著降低[12-13]。白色念珠菌可能通過菌絲的形成進(jìn)而增強該菌侵襲力和毒力，進(jìn)而增強對機體的致病能力。此外，菌絲形態(tài)能夠增強細(xì)胞的黏附性，有助于增強白色念珠菌的組織滲透能力及逃避吞噬細(xì)胞的吞噬[14-15]。因此，菌絲的形成可以改變白色念珠菌很多毒力因子的表達(dá)，使得細(xì)胞更易發(fā)生黏附作用，并且不被吞噬細(xì)胞吞噬，導(dǎo)致菌株毒力增加，感染性增強。

2 白色念珠菌菌絲形成的分子調(diào)控機制

多種外界環(huán)境可以誘導(dǎo)白色念珠菌的菌絲形成，主要包括中性pH值、體溫(37℃)、血清、CO2、N-乙酰神經(jīng)酰胺、L-脯氨酸及特殊的營養(yǎng)成分和微需氧條件等。在溫度較低、偏酸性的環(huán)境下，白色念珠菌以酵母型細(xì)胞進(jìn)行生長；在高溫、中性環(huán)境下，白色念珠菌則以菌絲型進(jìn)行生長。臨床上經(jīng)常用于診斷白色念珠菌感染的經(jīng)典測試方法——芽管形成實驗，就是采用在含有血清的培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)真菌觀察是否有菌絲的形成來判斷是否存在白色念珠菌的感染。此外，一些合成培養(yǎng)基(如Lee’s medium,Spider medium等)、動物組織(老鼠的腎臟)、鐵匱乏以及被巨噬細(xì)胞吞噬等都可以誘導(dǎo)白色念珠菌的菌絲形成[16-20]。因此，白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換可以在非常廣泛的環(huán)境條件下發(fā)生，該菌可以對多種信號刺激做出反應(yīng)，促使其能夠適應(yīng)宿主所呈現(xiàn)出的環(huán)境條件。

白色念珠菌菌絲的形成是一個高度極性化的過程，該過程受多種信號通路的共同調(diào)節(jié)，既有正調(diào)控，也有負(fù)調(diào)控。其中，負(fù)調(diào)控是通過Tup1與Nrg1共同發(fā)揮作用的。NRG1缺失突變體細(xì)胞在非誘導(dǎo)條件下仍然表現(xiàn)為絲狀生長，其菌落形態(tài)與TUP1缺失突變體相似。在非誘導(dǎo)條件下Nrg1可以抑制另外兩個菌絲特異性基因ECE1和HWP1的轉(zhuǎn)錄，而這兩個基因是Tup1調(diào)控的下游基因。Nrg1可能是通過招募Tup1作用于靶基因，參與對白色念珠菌菌絲形成的負(fù)調(diào)控。在37℃，血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)白色念珠菌，誘導(dǎo)菌絲形成的過程中可檢測到，NRG1 mRNA的表達(dá)量降低，這表明絲狀生長是由NRG1下調(diào)引起的[21]。此外，TUP1、NRG1單缺失或兩者均缺失的白色念珠菌菌絲形成能力大大提高，甚至不能形成酵母型細(xì)胞。因此，NRG1、TUP1這兩個基因在菌絲形成過程中起關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用[22-23]。

參與正向調(diào)控菌絲形成的關(guān)鍵因子較多，包括Efg1、Cph1、Ras1、Czf1、Hgc1和Brg1等[24]。這些正向調(diào)控因子能夠?qū)νㄟ^不同絲狀化途徑傳輸?shù)男盘栕鞒龇磻?yīng)，或者能夠進(jìn)一步從多個途徑傳遞信號。Cph1介導(dǎo)的MAPK通路以及Efg1介導(dǎo)的cAMP-PKA通路是白色念珠菌二型性轉(zhuǎn)換調(diào)控機制中被研究的比較清楚的兩條信號通路[25-27]。當(dāng)白色念珠菌在低氮環(huán)境中培養(yǎng)時，可激活有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路，信號通過Cst20→Ste11→Hst7→Cek1傳遞，最后通過Cph1誘導(dǎo)菌絲形成。MAPK信號通路中成員缺失時能夠?qū)е略诤芏嗾T導(dǎo)條件刺激下菌絲形成缺陷，然而所有這些基因缺失的突變體在血清誘導(dǎo)下依然能夠正常形成菌絲。這表明血清對菌絲形成的誘導(dǎo)不是通過MAPK信號通路完成的。當(dāng)cAMP表達(dá)量提高可以激活Bcy1，隨后激活兩個PKA的催化亞單位Tpk1和Tpk2，但這兩個亞單位在不同的菌絲形成條件下對菌絲生長的作用并不相同，tpk1Δ在固體培養(yǎng)基中菌絲缺陷明顯，而tpk2Δ突變體在液體培養(yǎng)基中表現(xiàn)出嚴(yán)重的菌絲形成缺陷。這兩個催化亞單位都可以作用于轉(zhuǎn)錄因子Efg1，Efg1可以結(jié)合在菌絲形成特異性基因的啟動子上，上調(diào)基因的表達(dá)從而誘導(dǎo)菌絲的形成[28]。此外，還存在一些基因同時調(diào)控這兩條重要的信號通路，如白色念珠菌唯一的Ras蛋白Ras1可以刺激cAMP-PKA和MAPK這兩條信號通路，參與調(diào)控細(xì)胞的菌絲形成[27]。

在白色念珠菌中Czf1介導(dǎo)了一條新的、對物理因素有反應(yīng)的信號通路。Czf1通過Dck1介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)菌絲的形成，該信號通路的誘導(dǎo)因素是侵入和缺氧。當(dāng)白色念珠菌進(jìn)行侵入生長時，提高Czf1的表達(dá)量可以促進(jìn)菌絲的形成。另一方面，當(dāng)Czf1缺失后使得白色念珠菌在侵入性生長時菌絲形成出現(xiàn)缺陷[29]。

Cph2、Tec1和Bcr1構(gòu)成了另外一條新的調(diào)控白色念珠菌菌絲形成的信號通路。Cph2是myc家族的bHLH型轉(zhuǎn)錄因子，在液體Lee’s培養(yǎng)基中，cph2Δ突變體出現(xiàn)菌絲形成缺陷。Tec1屬TEA/ATTS轉(zhuǎn)錄因子家族，缺失后白色念珠菌菌絲形成能力減弱，Cph2可直接結(jié)合在TEC1啟動子區(qū)的兩個特異性位點上。TEC1的異位表達(dá)可以抑制cph2突變體的菌絲形成缺陷，因此，Cph2可部分通過Tec1調(diào)控菌絲的形成。此外，Tec1還可能作用于Efg1的下游，并受其部分調(diào)控，因此Tec1可受到Cph2和Efg1的共同調(diào)控。而Bcr1可作用于Tec1的下游并激活菌絲形成相關(guān)的黏附基因的表達(dá)，這兩個基因一起作用于與菌絲形成相關(guān)的黏附基因的表達(dá)，如HYR1、HWP1、ASL3等[28]。

還有一些基因如RIM101、RIM8主要參與pH信號調(diào)控通路。在酸性和堿性兩種不同的環(huán)境下，RIM101可以被加工成不同的蛋白質(zhì)，RIM101在堿性條件下被加工成74-kD的活性形態(tài)；在酸性環(huán)境下，被加工成功能未知的65-kD的活性蛋白。此外，RIM101的激活還需要RIM8、RIM13和RIM20的輔助，這4個蛋白任意一個的缺失都將導(dǎo)致菌絲形成的障礙，影響白色念珠菌的毒力以及降低對上皮細(xì)胞的黏附作用[30]。

白色念珠菌菌絲形成過程的調(diào)控復(fù)雜多變，在不同環(huán)境下參與調(diào)控的分子信號通路并不相同，因此，也使得在臨床上試圖通過控制白色念珠菌的菌絲轉(zhuǎn)換來達(dá)到控制感染這一目的較難實現(xiàn)。未來的研究應(yīng)該更多的集中在白色念珠菌是如何在人體生理環(huán)境中完成菌絲轉(zhuǎn)換的，將該生理環(huán)境下的調(diào)控過程了解清楚后可以給藥物學(xué)家提供準(zhǔn)確的新的藥物靶點，從而進(jìn)行有目的的新藥研發(fā)，以期找到新的真菌感染的治療方法。

3 菌絲的免疫調(diào)節(jié)作用

白色念珠菌是一種機會致病性真菌。人體的免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞可以通過不同的方式感知白色念珠菌的侵襲并做出相應(yīng)的反應(yīng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這些免疫應(yīng)答有助于消除機體感染。

白色念珠菌是人口腔中正常菌群的組成部分，可以酵母菌或菌絲的形式存在?？谇簧掀ぜ?xì)胞可以通過NF-κB以及雙向MAPK調(diào)節(jié)對白色念珠菌產(chǎn)生先天性的組織反應(yīng)。NF-κB的激活和MAPK第一階段的調(diào)節(jié)引起c-jun激活，該激活過程與真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換無關(guān)，而是源于對真菌細(xì)胞壁的識別。MAPK的第二階段，MKP1和c-fos激活，該過程與菌絲形成及真菌壓力相關(guān)，并伴隨著促炎反應(yīng)的進(jìn)行。這種雙向反應(yīng)可使上皮組織細(xì)胞在真菌含量較少的情況下保持靜止，同時又可以對外界大量的真菌以及有大量可導(dǎo)致傷害的菌絲存在時及時的做出特異的、有效的反應(yīng)。MAPK/MKP1/C-FO可能是一條“危險反應(yīng)”信號通路[24]，該通路可以對共生微生物發(fā)生的致病性轉(zhuǎn)換進(jìn)行識別，并作出相應(yīng)反應(yīng)的一條信號調(diào)節(jié)通路，從而使得機體免受來自共生微生物損害[31]。因此，通過抑制白色念珠菌菌絲轉(zhuǎn)換而發(fā)揮作用的抗毒力治療有很大的優(yōu)勢，它采用有利于宿主對抗感染的方式，調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。

4 抑制白色念珠菌菌絲小分子化合物的篩選

在過去的幾年中，一些科學(xué)家通過細(xì)胞表型鑒定對白色念珠菌的小分子抑制劑進(jìn)行了高通量篩選并取得一定的成就。

為了找到新的能夠抑制白色念珠菌菌絲轉(zhuǎn)換的小分子抑制劑，Toenjes等[32]采用基于微板的形態(tài)學(xué)實驗對美國波士頓哈佛醫(yī)學(xué)院的Longwood 化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)協(xié)會(Institute of Chemistry and Cell Biology at Longwood,ICCB-longwood)篩選中心收集的已知生物活性物質(zhì)進(jìn)行檢測。在480個被檢測的分子中，53個對白色念珠菌具有細(xì)胞毒性，16個能夠在不影響出芽繁殖的情況下抑制菌絲轉(zhuǎn)化。這16種菌絲轉(zhuǎn)化抑制劑分別影響了蛋白激酶、蛋白磷酸酶、ras信號通路、G蛋白偶聯(lián)受體、鈣穩(wěn)態(tài)、一氧化氮和鳥苷酸環(huán)化酶信號傳導(dǎo)以及哺乳動物細(xì)胞的凋亡。其中一些分子還能夠抑制其他念珠菌屬細(xì)胞的菌絲轉(zhuǎn)換生長，這表明這些抑制活性分子具有廣泛的抗真菌作用。因此，這些分子活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)一方面可以幫助我們豐富菌絲轉(zhuǎn)換的分子信號調(diào)控通路網(wǎng)絡(luò)，另一方面這些分子活性物質(zhì)還有可能成為潛在的新抗真菌治療的藥物。

Fazly等[33]通過細(xì)胞表型，從一個小分子文庫(DIVERset Chembrid)中對3萬個小分子進(jìn)行高通量篩選，以尋找可以抑制白色念珠菌與聚苯乙烯表面粘附的化合物。篩選得到一種先導(dǎo)化合物，該化合物可以強烈并長期抑制菌絲的生長，被命名為“filastatin”，“filastatin”可以阻斷菌絲特異性啟動子HWP1的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，并在多個(但不是全部)信號通路的下游發(fā)揮作用。值得注意的是，在白色念珠菌感染的線蟲模型和患有外陰陰道念珠菌病的小鼠模型中，“filastatin”表現(xiàn)出較好的抗真菌活性。

Pierce等[34]利用美國國家癌癥研究所的開放化學(xué)儲存庫中的3個不同的化學(xué)庫(Natural set,Structural Diversity set and Challenge set)中的化合物對白色念珠菌進(jìn)行了基于細(xì)胞形態(tài)的篩選，通過表型的變化鑒定化學(xué)庫中化合物的作用，最終鑒定了幾種對白色念珠菌生物膜形成和/或絲狀化具有抑制活性的化合物。通過微滴度平板法篩選能夠抑制菌絲形成及生物被膜形成的化合物，然后在患有血液傳播念珠菌病的動物模型中檢測該化合物的功能。在被篩選的2293種化合物中，總共有17種化合物被確認(rèn)為白色念珠菌菌絲形成抑制劑，其中一些化合物的抗菌活性在之前已經(jīng)被描述過[35]。

然而以上發(fā)現(xiàn)的這些化合物對白色念珠菌的二型性轉(zhuǎn)換的作用機制目前并不清楚，因為白色念珠菌菌絲的形成與菌株寄存的外周環(huán)境及多種信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，我們猜測這些化合物可能通過影響白色念珠菌的寄生環(huán)境及信號通路影響白色念珠菌的二型性轉(zhuǎn)換。另一方面，據(jù)檢測大多數(shù)化合物仍然具有細(xì)胞毒性，這一發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重限制了它們作為新型抗真菌藥物被用于開發(fā)候選藥物的潛能。到目前為止，這些基礎(chǔ)科學(xué)中的發(fā)現(xiàn)很難在臨床治療上獲得轉(zhuǎn)化，并沒有為治療白色念珠菌感染提供新的療法。尋找新的能夠應(yīng)用于臨床治療的抗真菌藥物將成為未來的一大研究熱點，相信通過科學(xué)家不斷的努力將為臨床上解決真菌感染的問題提供新的思路和方法。

5 小結(jié)與展望

白色念珠菌的菌絲在白色念珠菌引起的感染中發(fā)揮了非常重要的作用。菌絲作為產(chǎn)生毒力因子強有力的靶點，在現(xiàn)在以及未來都會是一大研究熱點。白色念珠菌病的發(fā)病機制和毒力因子的關(guān)系以及毒力因子的組成都非常復(fù)雜，涉及很多的理化因素和調(diào)控機制，與此相關(guān)的研究很多但依然沒有形成非常清晰的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，仍需要開展更多的研究以獲得新的進(jìn)展。伴隨著分子生物化學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，新技術(shù)的應(yīng)用，對白色念珠菌的致病機制和毒力因子的深入研究在不久的將來將會有大的突破。而這些新的突破也將為尋找和開發(fā)系統(tǒng)性治療藥物以及研制疫苗提供了理論基礎(chǔ)，具有非常重要的意義。