王冰玉 ，蔡 穎 ，鄭 凱，謝紅衛(wèi)，徐新云

(1．深圳市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康所，廣東 深圳 518055；2．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

細顆粒物(fine particulate matte，PM2.5)指空氣中空氣動力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5μm的顆粒物[1-2]。因其易附帶有毒、有害物質(zhì)，且粒徑小，活性強，易較長時間懸浮在空氣中，對大氣環(huán)境以及人體健康都產(chǎn)生較大的危害作用，尤其是對呼吸系統(tǒng)的威脅最為嚴(yán)重[3]。已有許多研究表明，PM2.5短期暴露后，可使局部支氣管的通氣功能下降；長期暴露后，可發(fā)生支氣管炎、哮喘甚至肺癌[4]。隨著工業(yè)發(fā)展和經(jīng)濟水平快速提高，我國大氣中PM2.5濃度的增加，遠高于世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的空氣質(zhì)量水平[4]，導(dǎo)致空氣污染加劇，對人類健康造成了極大的威脅，因此，探討PM2.5的致病機制和預(yù)防控制措施十分重要。

基因芯片是20世紀(jì)80年代中期提出來的一種基于堿基雜交互補原理進行大量的基因表達及監(jiān)測等的技術(shù)，因其具備高通量、自動化、高效等特點，越來越為廣大科研工作者所青睞，為進一步探索疾病的發(fā)病機制及其臨床診斷和治療具有重要意義?；蛐酒址QDNA集微芯片、DNA微陣列技術(shù)，其主要原理是分子生物學(xué)中的核酸分子原位雜交技術(shù)，通過技術(shù)手段將DNA片段固定到介質(zhì)上，隨后將熒光標(biāo)記樣本與其雜交，從而對樣本基因進行規(guī)模檢驗[5]。江勇等發(fā)現(xiàn)基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)功能分析可以發(fā)現(xiàn)肝癌潛在的發(fā)病機制和核心基因，為肝癌的診斷和治療提供了依據(jù)[6]。儲海燕等運用基因芯片技術(shù)檢測了染毒PM2.5后人支氣管上皮細胞全基因組的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)表達變化的基因中的一部分也可能導(dǎo)致了心腦血管疾病的發(fā)生[7]，將A549細胞暴露于PM2.5中已知的有機物成分中，發(fā)現(xiàn)A549細胞的基因表達譜發(fā)生改變，并且通過GO分析發(fā)現(xiàn)這些發(fā)生改變的基因主要參與芳烴受體的激活、內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝，從而影響細胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、癌變及増殖過程[8]。基于上述研究，利用基因芯片技術(shù)對PM2.5毒性的研究是非常有意義的，為之后的鑒定和課題深入研究奠定基礎(chǔ)。人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells，HBE)是永生化人支氣管細胞系，仍保持人支氣管上皮細胞及非致瘤性特征，且PM2.5對人群的危害，首先波及上呼吸道，選用HBE細胞作為實驗處理對象，可使實驗結(jié)果更接近人群真實情況。本文采用基因芯片技術(shù)，對PM2.5暴露的HBE細胞以及對照組進行差異基因篩選[8]，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，進一步對篩選得到的差異基因進行聚類以及功能富集分析，篩選與PM2.5致癌致突變的核心基因以及構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，以探討PM2.5致HBE細胞基因表達水平的改變情況，為進一步研究PM2.5對HBE的毒性作用機制提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HBE細胞購于中國上海細胞庫，PM2.5樣品來源山西省太原市，胎牛血清(FBS)、0.25%Trpsin-EDTA購于美國Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司，QIAGEN RNeasy?Mini Kit試劑盒購于德國QIAGEN公司，氨基烯丙基擴增試劑盒(Amino Allyl MessageAmp II aRNA Amplification Kit，AM1753)購于美國Ambion公司。

1.2 PM2.5的采集和制備

實驗用武漢天虹TH150 F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續(xù)采樣，每天采樣24 h，采樣地點在山西省太原市山西大學(xué)校園內(nèi)，采集時間為2018年12月。將吸附有PM2.5顆粒的石英濾膜剪成4小塊放入裝有超純水的燒杯中，用錫紙包住口，超聲振蕩30 min洗脫PM2.5顆粒物，冷卻至室溫后放入-80℃冰箱。然后將樣品洗脫液真空冷凍干燥24 h后紫外線照射1 h，加入無菌水制備成PM2.5樣品儲備液，高壓滅菌后可用于細胞實驗，使用前振蕩混勻。

1.3 細胞培養(yǎng)與染毒處理

用10%的胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基將HBE細胞培養(yǎng)于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積的70%～80%時，將培養(yǎng)的細胞消化后進行計數(shù)，調(diào)節(jié)懸液濃度，然后以5×105個/mL的濃度接種至6孔板，每孔加2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，待細胞鋪滿瓶底面積的80%左右時進行PM2.5染毒處理，染毒濃度為50μg/mL，染毒時間24 h。

1.4 基因芯片

本研究使用的基因芯片由華大基因生物技術(shù)公司提供的人類基因體芯片(human OneArrayTM，HOA)，是以UniGene最新數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，應(yīng)用IMPORT專利技術(shù)進行探針的開發(fā)，設(shè)計高度專一化的60-mer寡核苷酸探針。每一芯片上布放超過3萬個探針，涵蓋3萬以上個基因及數(shù)種實驗控制探針。

1.5 方法

1.5.1 樣本RNA提取和純化HBE細胞的總RNA使用QIAGEN RNeasy?Mini Kit試劑盒提取和純化細胞總RNA，通過NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)進行RNA濃度和純度的檢測，通過安捷倫RNA 6000 nano assay檢測RIN值來判斷RNA的完整性。

1.5.2 樣本制備質(zhì)控樣本制備包含RNA擴增及熒光標(biāo)記。使用AM1753試劑盒擴增得到氨基-烯丙基反義 RNA(Amino-allyl antisense RNA， aa-aRNA)， 與NHS-CyDye(Cy5)反應(yīng)結(jié)合完成熒光標(biāo)記與純化后進行芯片雜交。本步驟質(zhì)控使用NanoDrop ND-1000對完成標(biāo)記的aa-aRNA定量，Cy5的標(biāo)記效率需達到每1 000個核苷酸包含15染料分子以上，同時采用D(260)/D(280)鑒定其純度。

1.5.3 芯片雜交與掃描芯片組合后，配制RNA混合物與變性物，用其將芯片雜交后將芯片清洗。將預(yù)熱于50℃烘箱中的芯片取出，于芯片第1層切口處加入加熱反應(yīng)完后的RNA mixture(180μL)。完成后套上第2層熱縮膜，放入50℃雜交烘箱旋轉(zhuǎn)架上，烘箱轉(zhuǎn)速設(shè)定約為2 r/min、反應(yīng)時間16 h。用預(yù)先準(zhǔn)備的42℃雜交清洗液I、II及25℃雜交清洗液II將芯片清洗，清洗后將芯片上的水分甩干后將芯片置于黑色芯片盒中，避光等待掃描。使用掃描儀Molecular Devices之AXON4000B掃描芯片。借由適當(dāng)?shù)臒晒鈴姸仍O(shè)定與分辨率(10μm)獲得影像(tiff格式)。利用GenePixTM4進行影像數(shù)據(jù)擷取，獲得初級數(shù)據(jù)格式gpr檔案即完成將影像轉(zhuǎn)成數(shù)值，進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.6 生物信息分析

1.6.1 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理和基因差異分析基因表達譜檢測芯片的數(shù)據(jù)分析是用 Rosetta Resolver?System(Rosetta Biosoftware)進行數(shù)據(jù)前處理(含數(shù)據(jù)篩選、校正)與統(tǒng)計分析。利用基因表達倍數(shù)變化值(fold change，F(xiàn)C)篩選差異表達基因，篩選條件滿足log2|FC|≥1且P＜0.05；比對組別中至少一個樣本的探針訊號≥200，縮小FC的范圍，進一步分析篩選出前10個上調(diào)基因和前10個下調(diào)基因。

1.6.2 GO功能注釋、通路及生物學(xué)功能富集分析使用Cluster Profiler軟件對篩選得到的差異基因在GO中注釋，并進行通路及生物學(xué)功能富集注釋分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能和通路。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6.3 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖分析通過String軟件分析差異表達基因的蛋白互作關(guān)系，并以此來構(gòu)建蛋白質(zhì)相互互作用網(wǎng)絡(luò)圖。將String蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫分析得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過網(wǎng)絡(luò)分析插件CytoHubba計算節(jié)點的邊(即互作連線的數(shù)量)，篩選得到網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(hub node)。中心節(jié)點對應(yīng)的基因即為核心蛋白。

2 結(jié)果

2.1 樣品RNA的總量與純度

本研究收集的樣品RNA總量與純度見表1，可見其符合實驗要求。

表1 樣品RNA的總量與純度

2.2 基因的差異表達與聚類分析

根據(jù)差異表達篩選條件，在基因芯片實驗結(jié)果中，PM2.5染毒處理HBE細胞后，共篩選出245個差異表達的基因，見表2。其中上調(diào)基因27個，下調(diào)基因218個，差異表達基因火山圖見圖1A。log2|FC|＜-1的為下調(diào)基因所在范圍，log2|FC|＞1為上調(diào)基因所在范圍，進一步縮小篩選范圍篩選出排名前10的上調(diào)基因和下調(diào)基因為核心基因。通過聚類分析可視化重復(fù)及樣本間的相似性做出熱圖(圖1B)。本分析中以差異表達基因探針在所有芯片間的差異基因，篩選出前250基因探針進入分析。

2.3 差異表達基因的GO功能注釋和富集分析

將篩選出的差異表達基因進行GO功能注釋和富集分析，結(jié)果表明，差異表達基因在分子功能(mlecular function，MF)、生物過程(biologicalprocess，BP)及細胞組成(cellular component，CC)的分布是存在差異的。分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要由細胞膜的固有成分、胞膜、細胞外圍等成分組成，富集在跨膜受體活性、受體活性、細胞信號傳導(dǎo)、細胞分子傳導(dǎo)等分子功能。同時富集于離子跨膜轉(zhuǎn)運、細胞對脂多糖無機離子跨膜轉(zhuǎn)運、細胞營養(yǎng)轉(zhuǎn)運等生物過程，見圖2。

表2 PM 2.5染毒后核心基因表達

圖1 PM2.5染毒HBE細胞后的基因差異表達火山圖和聚類分析熱圖

2.4 差異表達基因的KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果顯示有7個最顯著的富集通路，核心富集通路表見表3，其主要涉及腫瘤細胞遷移、信號傳導(dǎo)、膽汁代謝相關(guān)、遺傳毒性等方面。排名前7的生物途徑富集分析見圖3，包括富集程度排名第1、與腫瘤細胞生長、腫瘤發(fā)生和遷移相關(guān)的focal adhesion通路，富集程度排名第2的與膽汁代謝相關(guān)的bile secretion通路，與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)相關(guān)的ABC transporters通路等。

圖2 差異表達基因的GO功能注釋和富集分析圖

表3 核心富集通路表

圖3 排名前7的生物途徑富集分析

2.5 蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

使用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫分析處理差異基因，構(gòu)建蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)，根據(jù)Cytoscape軟件篩選節(jié)點數(shù)最相關(guān)的5個核心蛋白，對應(yīng)的基因分別為生長抑素基因SST、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因BDNF、神經(jīng)細胞黏附分子1基因NCAM1、生長抑素受體1基因SSTR1和凋亡基因BCL2類11基因Bcl2L11。

3 討論

在我國許多城市，大氣PM2.5水平嚴(yán)重超岀WHO的標(biāo)準(zhǔn)。PM2.5空氣污染持續(xù)影響人群的公共健康，在可改變的危險因素中，空氣污染位列造成我國疾病負擔(dān)的第4位[9]，中國排名前4位的死因分別是腦卒中(23.92%)，肺部疾病(14.28%)，冠心病(11.71%)以及肺腫瘤(5.19%)，這4種疾病均與PM2.5相關(guān)。而本文應(yīng)用基因芯片檢測PM2.5對HBE細胞基因表達譜的影響，從而為探究PM2.5致癌機制提供科學(xué)依據(jù)。

本研究用PM2.5急性染毒HBE細胞24 h，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)深入分析其基因芯片的結(jié)果。根據(jù)篩選條件結(jié)果顯示上調(diào)基因27個，下調(diào)基因218個。這些結(jié)果提示PM2.5影響HBE細胞的基因轉(zhuǎn)錄過程。通過對差異基因的GO功能注解聚集分析和KEGG生物途徑富集分析，結(jié)果顯示差異基因表達主要富集于細胞分子傳導(dǎo)等分子功能，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在跨膜受體活性、細胞信號傳導(dǎo)等分子功能。同時富集于離子跨膜轉(zhuǎn)運、細胞營養(yǎng)轉(zhuǎn)運等生物過程。KEGG富集分析顯示，HBE細胞中差異表達的基因涉及通路有與腫瘤細胞遷移相關(guān)的黏著力，與膽汁代謝相關(guān)的膽汁分泌，與神經(jīng)毒性、遺傳毒性相關(guān)的神經(jīng)活性配體-受體相互作用，參與細胞分化、免疫、凋亡的信號通路JAK-ATAT，這些為PM2.5致細胞凋亡和致癌作用機制提供了參考。

抑癌基因的正常功能是抑制細胞的生長，其表達下調(diào)導(dǎo)致功能的缺失有助于腫瘤的發(fā)生，WAP-4-二硫核結(jié)構(gòu)域蛋白(WAP four-disulfide core domain 1，WFDC1)基因定位于人染色體16q24.1上，最初被認(rèn)為是一種抑癌基因[10]，有研究表明，在肺、肝、膀胱和卵巢腫瘤中可以觀察到WFDC1基因的表達下調(diào)[11-13]，本文篩選出明顯差異低表達的WFDC1基因，可推測PM2.5染毒使抑癌基因WFDC1的表達異常下調(diào)，從而使其功能的缺失。Wnt信號通路與細胞的發(fā)育分化密切相關(guān)，對正常和腫瘤細胞生長都至關(guān)重要，因其啟動蛋白為Wnt蛋白而得名[14]。研究表明SFRPs是分泌型蛋白，能結(jié)合Wnt，干涉Wnt信號通路傳導(dǎo)，其或與受體競爭結(jié)合Wnt蛋白，或直接與Wnt蛋白結(jié)合，阻斷Wnt信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]，本實驗結(jié)果顯示分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled related protein 1，SFRP1)基因的差異高表達，提示PM2.5染毒HBE細胞后Wnt通路被激活，從而導(dǎo)致Wnt通路拮抗劑基因SFRP1的高表達。此外，本次研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理后，排名前10的表達上調(diào)的基因中，磷酸酶肌動蛋白調(diào)節(jié)因子1(phosphatase and actin regulator 1，PHACTR1)基因是排位第1，上調(diào)最明顯的基因；有研究表明此基因與小鼠急性肺損傷有關(guān)[16]，且此基因是肺癌DNA修復(fù)能力的決定性因素之一[17]，PHACTR1基因的高表達提示，PM2.5對HBE細胞的DNA損傷有一定影響，DNA損傷通常被認(rèn)為是引起細胞癌變或突變的重要原因。本課題組計劃在接下來的實驗中，將重點針對與致癌相關(guān)的WFDC1、SFRP1基因，與DNA損傷相關(guān)的PHACTR1基因，進一步驗證這些基因與PM2.5致癌致突變作用的分子機制。

綜上所述，PM2.5染毒HBE細胞后，其基因表達譜發(fā)生多方面的變化，涉及許多生物過程和通路的改變。本課題重點關(guān)注PM2.5致癌致突變作用，本文篩選出來的與PM2.5致癌致突變的差異基因及其相關(guān)蛋白和通路，為進一步深入研究PM2.5毒性作用機制提供了非常有價值的信息和新的研究方向。