封 敏，艾比拜·莫合塔爾，石靜怡，祖可來(lái)·艾力江，李永祥，閆長(zhǎng)順，李秀梅

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830011；2．新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，新疆 烏魯木齊 830011；3．新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

2012年全球腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(GLOBOCAN 2012)顯示食管癌(esophageal cancer，EC)是目前世界上常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有癌癥原因死亡率的第6位，5年生存率僅為15%～25%[1]。食管癌的患病率因地區(qū)變化而顯著不同，在新疆，哈薩克族居民食管癌發(fā)病率(155.9/10萬(wàn))明顯高于其他少數(shù)民族[2]。小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類(lèi)具有組織特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)特征的非編碼調(diào)控的小RNA，在動(dòng)植物基因組中，已發(fā)現(xiàn)存在大量簇生排列的MIR基因，常位于一個(gè)多順?lè)醋觾?nèi)，稱(chēng)為MIR基因簇，其通過(guò)共表達(dá)影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期和細(xì)胞分化等諸多方面，MIR143/145基因簇同位于染色體5q32位點(diǎn)上，是目前發(fā)現(xiàn)的一對(duì)具有重要生物學(xué)功能的MIR基因簇[3]。

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，其表達(dá)上調(diào)在眾多腫瘤發(fā)生中是一個(gè)早期事件，高表達(dá)Survivin的抗凋亡、促增殖作用在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。而miR-143、miR-145是我們前期采用microRNA芯片篩查出的在食管癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的microRNA，靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示Survivin是miR-143的靶基因，但三者之間的關(guān)系在惡性腫瘤中研究較少，在哈薩克族食管癌中的研究未見(jiàn)報(bào)道，故本文采用熒光定量PCR方法檢測(cè)47例新疆哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中miR-143、miR-145和Survivin mRNA的表達(dá)情況，分析其與哈薩克族食管癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步了解哈薩克族食管癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

47例新疆哈薩克族食管癌組織及癌旁組織組織均取自2016—2018年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放化療，手術(shù)中取材后迅速將標(biāo)本置于液氮中，并于-80℃冰箱中貯存。病理切片均診斷為鱗狀上皮細(xì)胞癌，男性30例，女性17例。腫瘤按國(guó)際TNM分期(UICC，2009年)，Ⅰ期2例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；低分化28例，中高分化19例。

1.2 試劑和引物

miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RT-PCR引物，均購(gòu)于北京天根公司；RNA提取試劑Trizol購(gòu)于Promega公司。引物序列如下：miR-143， 上 游 5′-GAGCTACAGTGCTTC-3′， miR-145，上游 5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′，U6，上游 CTCGCTTCGGCAGCACA；Survivin，上游5′-TCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTC-3′，下游 5′-TC CTCACTGCGGCTGTCTGG-3′；GAPDH，上游 5′-TC TGGAGGTCATCTCGGCTGTTC-3′，下 游 5′-TCCTCA CTGCGGCTGTCTGG-3′。

1.3 組織總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

采用Trizol試劑一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度。以提取的RNA為模板，按miScript II RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件：94℃、2 min；94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃、5 min，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；miR-143、miR-145、Survivin mRNA在哈薩克族食管癌組織和癌旁組織中表達(dá)水平的比較采用t檢驗(yàn)；miR-143、miR-145、Survivin mRNA與哈薩克族食管癌臨床病理指標(biāo)關(guān)系的分析采用t檢驗(yàn)，Spearsman雙變量相關(guān)性分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的表達(dá)

47例哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，顯示與癌旁組織比較，腫瘤組織中miR-143、miR-145的相對(duì)表達(dá)水平均明顯下調(diào)，腫瘤組織中miR-143相對(duì)表達(dá)水平(0.31±0.08)約為癌旁組織的1/3，miR-145的相對(duì)表達(dá)水平(0.43±0.18)約為癌旁組織的1/2。與癌旁組織比較，腫瘤組織中Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(3.67±0.56)升高(P＜0.01)。

圖1 哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 哈薩克族食管癌組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織及Ⅱb～Ⅲ期的腫瘤組織中miR-143相對(duì)表達(dá)水平分別低于高分化、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及Ⅰ～Ⅱa期的腫瘤組織；而miR-145在低分化及淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中的表達(dá)分別低于高分化及淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅱb～Ⅲ期的腫瘤組織中Survivin mRNA的表達(dá)分別高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及Ⅰ～Ⅱa期的腫瘤組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 食管癌組織中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 miR-143、miR-145、Survivin mRNA相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)分析顯示在哈薩克族食管癌組織中miR-143與miR-145的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.662，P=0.000)，miR-143與Survivin mRNA的表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.313，P=0.002)。

3 討論

食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)食管癌的發(fā)病率具有明顯的地域性和民族特異性，在新疆，哈薩克族食管癌發(fā)病率最高，目前早發(fā)現(xiàn)、早治療是提高食管癌患者五年生存率的有效方法，因此，尋找食管癌早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物有重要意義。MIR基因簇通常定位于染色體的特殊區(qū)域，是MIR家族中的各成員緊密成簇排列成大串的重復(fù)單位，同屬于同一個(gè)祖先的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。MIR143/145是目前公認(rèn)的一對(duì)基因簇，在結(jié)構(gòu)上均不編碼蛋白，不含開(kāi)放閱讀框，同位于人類(lèi)的第5號(hào)染色體，具體位置分別在5：148808481-148808586 和 5： 148810209-148810296，在功能上發(fā)揮類(lèi)似的作用[4]。研究顯示在食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌等消化道腫瘤中miR-143和miR-145表達(dá)下調(diào)，且與細(xì)胞分化、腫瘤侵襲深度相關(guān)，體外劃痕實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，上調(diào)miR-143和miR-145表達(dá)可以顯著抑制食管癌細(xì)胞的遷移及細(xì)胞增殖，在食管癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用[5-6]。而新疆哈薩克族食管癌組織中miR-143和miR-145的表達(dá)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)了47哈薩克食管癌組織及癌旁組織中miR-143和miR-145的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，哈薩克族食管癌組織中的miR-143和miR-145表達(dá)水平顯著低于遠(yuǎn)端無(wú)癌組織，其中miR-143表達(dá)水平下調(diào)更明顯，僅為癌旁組織水平1/3，miR-143和miR-145表達(dá)正相關(guān)，病理因素分析顯示在低分化及淋巴轉(zhuǎn)移的哈薩克族食管癌組織中miR-143和miR-145表達(dá)顯著低于高分化及淋巴未轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，另外miR-143低表達(dá)還與臨床分期相關(guān)，隨著臨床病程的進(jìn)展，miR-143呈現(xiàn)持續(xù)低表達(dá)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在哈薩克族食管癌發(fā)生發(fā)展中miR-143和miR-145共同低表達(dá)，在哈薩克族食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，且MIR143/145基因簇的低表達(dá)更有利于食管癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。目前大量研究顯示miR-143和miR-145在肺癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤中呈低表達(dá)[7]，通過(guò)抑制下游靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成及腫瘤藥物的敏感性[8-13]，47例哈薩克族食管癌組織中miR-143和miR-145表達(dá)下調(diào)，結(jié)果與我們前期MIR基因芯片結(jié)果相一致，同時(shí)也與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本相符，但在哈薩克族食管癌中MIR143/145基因簇的協(xié)同作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

Survivin是人類(lèi)凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein family，IAP)家族中的分子量最小、凋亡抑制作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，也是我們前期在大量哈薩克族食管癌組織標(biāo)本中篩查出顯著差異表達(dá)的基因[14-15]，在哈薩克族食管癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的相關(guān)，Survivin高表達(dá)可以直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性從而抑制細(xì)胞凋亡，其次還可以間接地與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK4形成復(fù)合物，釋放出p21/CDK4復(fù)合體中的p21，從而直接抑制Caspase-3前體的激活，致使凋亡小體不能形成，阻斷細(xì)胞的凋亡過(guò)程[16-17]。曾劍等[18]實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Survivin表達(dá)陽(yáng)性的食管癌更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，惡性程度更高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其基本一致，提示在新疆哈薩克族食管癌的發(fā)展中Survivin高表達(dá)參與了食管癌的進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程，可以作為評(píng)估食管癌惡性程度及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)。

MIR生物學(xué)信息學(xué)靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件(包括PicTar、miRanda和TargetScan)高度提示Survivin是MIR143/145基因簇的靶基因，故本實(shí)驗(yàn)采用Spearman相關(guān)性分析顯示在47例哈薩克族食管癌組織標(biāo)本中miR143低表達(dá)、Survivin mRNA高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但miR-145的表達(dá)水平與Survivin mRNA的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)，我們推測(cè)在哈薩克族食管組織中miR-143和miR-145表達(dá)下調(diào)，作為一對(duì)基因簇發(fā)揮協(xié)同作用，低表達(dá)的miR143直接或間接導(dǎo)致Survivin mRNA高表達(dá)，從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，但在此過(guò)程中MIR143/145基因簇發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)中誰(shuí)占主導(dǎo)地位，其與Survivin之間具體的調(diào)控機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們將在后續(xù)的體外細(xì)胞試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

食管癌的發(fā)生是一系列內(nèi)外因素共同發(fā)揮效應(yīng)的綜合結(jié)果，多種microRNA和多種基因在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，而新疆哈薩克族食管癌高發(fā)，且預(yù)后差，五年生存率低，故尋求特異性高、靈敏的分子標(biāo)志物作為食管癌的早期診斷指標(biāo)具有重要意義。MIR143/145基因簇低表達(dá)與Survivin高表達(dá)共同發(fā)揮作用參與了哈薩克族食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，系統(tǒng)研究三者之間的關(guān)系有助于揭示在腫瘤發(fā)生發(fā)展中miRNA基因簇在腫瘤網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的作用。