饒秋華，劉 洋，周倫江，羅土炎，王隆柏*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建福州350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350013)

豬傳染性萎縮性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis，AR)，是由產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(ToxigenicPasteurellamultocida，T+Pm)引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病[1]。宿主在感染多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)發(fā)病的過程中，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)起到了重要的作用，根據(jù)LPS 基因編碼的不同，將其分為8 種LPS 基因型(L1～L8)，研究表明，當(dāng)LPS 的結(jié)構(gòu)被破壞后，Pm在宿主體內(nèi)的毒力降低[2-3]。此外，莢膜也是Pm 的主要致病因子之一，根據(jù)其莢膜抗原可將其分為A、B、D、E、F 5 個(gè)血清型，導(dǎo)致AR 的Pm 其主要為血清D 型，少數(shù)為血清A 型[4-5]。血清D 型的菌株能分泌一種由toxA基因編碼的巴氏桿菌毒素，直接引起豬的鼻梁變形，鼻甲骨萎縮，同時(shí)誘發(fā)其他病原微生物感染，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6-8]。

為查明福建南平市某豬場(chǎng)患病豬的主要病原，本研究通過采集患病豬的鼻腔拭子，對(duì)病原菌進(jìn)行分離和鑒定，并對(duì)分離菌株的血清型和致病性進(jìn)行分析，為今后該病原的致病機(jī)理、流行病學(xué)調(diào)查和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 瑞氏染色液購(gòu)自O(shè)XOID 公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TaqDNA 聚合酶、PCR 試劑、DNA Marker 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒購(gòu)自TianGen 公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；40 日齡巴氏桿菌陰性實(shí)驗(yàn)豬購(gòu)自福州某種豬場(chǎng)。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化 采集福建南平市某豬場(chǎng)30 份發(fā)病豬鼻腔拭子劃線涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)20 h 后，根據(jù)在顯微鏡下45°折光觀察到的形態(tài)特征挑取單個(gè)可疑菌落在改良馬丁肉湯培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)20 h 后經(jīng)瑞氏染色觀察。

1.3 分離菌株莢膜型及其毒力基因的鑒定 按照基因提取試劑盒說明書提取分離細(xì)菌的DNA，參照文獻(xiàn)[9]引物建立的PCR 方法鑒定其莢膜基因型，采用25 μL 反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。參照文獻(xiàn)[10]引物建立的PCR 方法對(duì)分離菌毒力基因toxA進(jìn)行鑒定，采用25 μL 反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 48 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，引物由吉林庫(kù)美生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 分離菌株的LPS 基因型檢測(cè) 按照基因提取試劑盒說明書提取分離細(xì)菌的DNA，參照文獻(xiàn)[2]引物建立的PCR 方法對(duì)其進(jìn)行LPS 基因型鑒定，采用25 μL 5 反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 12 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。反應(yīng)結(jié)束后PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 分離菌株的生化試驗(yàn) 將分離菌增菌液按照細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說明書操作，進(jìn)行葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、吲哚、MR、VP 等生化試驗(yàn)，置于37 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察其主要生化特性。

1.6 分離菌株的藥敏試驗(yàn) 挑取純化的單菌落進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將其接種于改良馬丁肉湯培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h 后，用液體培養(yǎng)基稀釋至最終濃度為3.0×108cfu/mL。用滅菌棉拭子均勻涂布在固體改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h后判定結(jié)果。

1.7 分離菌株對(duì)豬的致病性試驗(yàn) 將4 只40 日齡巴氏桿菌陰性豬平均分成2 組，隨機(jī)挑選分離好一株血清型為D 型的T+Pm 進(jìn)行致病性試驗(yàn)，一組滴鼻 + 肌注各 1 mL F5 代 D 型的 T+Pm 培養(yǎng)物，細(xì)菌含量為1.2×1010cfu/mL，另一組為PBS 對(duì)照，感染后連續(xù)觀察7 d，記錄臨床癥狀和死亡率。采集鼻拭子并進(jìn)行致病菌的分離，豬發(fā)病致死和撲殺后取肺組織固定于10 %福爾馬林溶液中，HE 染色觀察肺組織的病理變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 病原菌分離鑒定結(jié)果 采集發(fā)病豬鼻腔拭子劃線涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基平板上37 ℃培養(yǎng)20 h 后，改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上觀察到4 種不同形態(tài)特征的菌落，麥康凱培養(yǎng)基上無菌落生長(zhǎng)，疑似巴氏桿菌的菌落肉眼觀察為灰白色，油滴狀，邊緣整齊，可見光折射下呈藍(lán)色；在顯微鏡下45°折光觀察，菌落呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光，邊緣有紅藍(lán)黃虹彩(Fg 型)，瑞氏染色鏡檢可見大量?jī)蓸O濃染的單個(gè)菌體。表明分離出的可疑菌落形態(tài)學(xué)特征完全符合Pm 的特征。從30 份發(fā)病豬鼻拭子樣品中共分離出28 株P(guān)m。

2.2 分離菌株血清型和毒力因子檢測(cè)結(jié)果 對(duì)分離的巴氏桿菌進(jìn)行特異性PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，共有27 株菌株D 型和toxA檢測(cè)結(jié)果為陽性，A 型結(jié)果為陰性(圖1A)，表明分離到27 株D 型T+Pm；一株分離菌A 型結(jié)果為陽性，而toxA基因和D 型結(jié)果為陰性(圖1B)，結(jié)果表明分離出1 株表膜A 型Pm。綜上，表明致福建南平某豬場(chǎng)發(fā)病的主要病原菌為D 型 T+Pm。

圖1 巴氏桿菌血清型和毒力因子檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The identification of Pasteurella serotypes and virulence factors

2.3 分離菌株的LPS 基因型檢測(cè) 將分離的28 株P(guān)m 利用PCR 方法對(duì)其LPS 基因型進(jìn)行鑒定，僅鑒定出L6 型LPS，表明該豬場(chǎng)感染的Pm LPS 基因型單一，L6 型Pm 是導(dǎo)致AR 的重要致病菌。但AR的發(fā)生與Pm 基因型之間的關(guān)系需要更多地區(qū)AR的流行病學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4 分離菌株的生化反應(yīng)特性及藥敏性試驗(yàn) 分離菌株培養(yǎng)48 h 后，發(fā)現(xiàn)該分離菌可分解葡萄糖、果糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解麥芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚還原試驗(yàn)陽性，MR、VP 試驗(yàn)均為陰性。符合Pm 的生化特性。

莢膜A 型分離菌株藥敏結(jié)果顯示，分離的菌株對(duì)諾氟沙星、頭孢拉定等敏感，對(duì)青霉素、氟苯尼考、慶大霉素耐藥，莢膜D 型分離菌株的耐藥性結(jié)果顯示對(duì)諾氟沙星、頭孢拉定敏感的菌株有27 株，對(duì)青霉素耐藥的菌株有24 株、對(duì)氟苯尼考耐藥的有12 株、對(duì)慶大霉素耐藥的有20 株，從上述結(jié)果可以推斷出該養(yǎng)殖場(chǎng)存在抗生素濫用的情況，抗生素用藥不規(guī)范導(dǎo)致巴氏桿菌的耐藥性增加，AR 的治療效果下降[8]。

2.5 分離菌對(duì)豬的致病性試驗(yàn)結(jié)果 D 型分離菌感染豬后48 h，一只滴鼻+ 肌注實(shí)驗(yàn)豬突然死亡，死前口吐白沫，剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟呈熟肉樣病變，氣管內(nèi)有大量白色泡沫液體，并且在肺組織中分離到大量巴氏桿菌，經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該分離株與感染菌種為同一菌株。另一頭實(shí)驗(yàn)豬感染后48 h 出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，體溫最高時(shí)達(dá)40.7 ℃，生長(zhǎng)停滯(感染后21 d 迫殺，體重幾乎沒有增加)。剖檢時(shí)肺臟也呈熟肉樣病變，在肺組織中分離到大量巴氏桿菌。對(duì)照組沒有表現(xiàn)出臨床癥狀。病理組織切片顯示感染豬肺胸膜臟層輕度水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴少量散在出血，對(duì)照組的豬肺組織沒有病理變化(圖2)。結(jié)合以上藥敏試驗(yàn)結(jié)果，致病性分析結(jié)果表明，Pm 在養(yǎng)豬業(yè)實(shí)際生產(chǎn)過程中存在耐藥性增強(qiáng)、致病性增強(qiáng)的趨勢(shì)，因此在治療該病的臨床用藥過程中，需要設(shè)計(jì)合理的給藥方案，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)通過菌株的分離鑒定為該地區(qū)AR 的流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防及治療提供了參考依據(jù)。

圖2 豬豬肺組織病理變化Fig.2 Histopathology of lungs from pigs