張艷英，張召興，郭家媚，李蘊(yùn)玉，李佩國*，索 勛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京100094；2.河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島066004；3.河北旅游職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，河北承德067000)

雞大腸桿菌病是臨床常見的禽細(xì)菌性傳染病之一，該病對雛雞造成高發(fā)病率和死亡率，并導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能下降，對養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。大腸桿菌(Escherichia coli)是一種條件致病菌，具有血清型復(fù)雜、種類繁多等特點(diǎn)[2]。同時，人類食用被E.coli污染的食品，可引起食物中毒，是一種具有重要公共衛(wèi)生意義的病原菌[3]。

大腸桿菌的膜系統(tǒng)由三層組成：細(xì)胞質(zhì)膜、肽聚糖層和共價連接的外膜[3]。這種膜系統(tǒng)可以保護(hù)細(xì)菌免受環(huán)境應(yīng)激、賦予其耐藥性，并具有免疫防御功能[4]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，外膜蛋白(Outer membrance protein，OMPs)具有免疫原性和免疫保護(hù)性，可作為潛在的評估中的候選疫苗之一[5-7]。為了探索致病性大腸桿菌OMPs 的組成結(jié)構(gòu)及抗原性，本實(shí)驗(yàn)通過對不同血清型地方流行株的致病性大腸桿菌菌株進(jìn)行OMPs 提取，電鏡觀察其結(jié)構(gòu)，分析了其反應(yīng)原性，并免疫小鼠和雞，評價其免疫保護(hù)性，為致病性大腸桿菌的亞單位疫苗的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與實(shí)驗(yàn)動物 不同血清型的致病性大腸桿菌 ：O157/O147/O142、 O107、 O91/O89、 O89/O48、O142、O18/O157、O59/O45、O18、O89/O78、O38，依次編號為EC-1～EC-10，均由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存；體質(zhì)量約20 g 的清潔級昆明鼠及雞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，實(shí)驗(yàn)前在動物隔離器適應(yīng)環(huán)境1 周。

1.2 主要試劑 ML1640 不完全培養(yǎng)基、ML1640完全培養(yǎng)基購自Gibco 公司；刀豆蛋白A、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑購自Sigma 公司；MTT、淋巴細(xì)胞分離液、兔抗雞大腸桿菌陽性血清、山羊抗兔IgG-HRP 購自北京九州天瑞科技有限公司；四氨基聯(lián)苯胺(TMB) 購自Amresco 公司；ECL 檢測試劑盒購自上海貝博生物公司；通用顯色粉、通用定影粉購自天津市世紀(jì)奧博商貿(mào)有限公司；雞大腸桿菌蜂膠滅活疫苗購自山東華宏生物工程有限公司。

1.3 雞致病性大腸桿菌OMPs 提取及超微結(jié)構(gòu)觀察 利用超聲波破碎儀將10 株不同血清型的致病性大腸桿菌破碎后，采用Sarkosyl 法[8]進(jìn)行OMPs 提取，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后測定其濃度[9]。將提取的OMPs 經(jīng)2 %醋酸鈾染色2 min 后，去除多余染料，晾干后在透射電鏡下觀察。

1.4 OMPs SDS-PAGE 檢測和 western blot 鑒定采用SDS-PAGE 分析提取的OMPs 分子量；同時以兔抗雞大腸桿菌陽性血清(1∶300)為一抗，山羊抗兔HRP-IgG (1 ∶1 000)為 二 抗 ， 采 用 western blot 鑒 定OMPs 的反應(yīng)原性。

1.5 OMPs 對小鼠的免疫效果評價 參照文獻(xiàn)[10]，選取E.coliEC-9 菌株 OMPs 進(jìn)行免疫試驗(yàn)。將105 只健康昆明系小鼠隨機(jī)分成3 組，每組35只，設(shè)蛋白免疫組(OMP+ 弗氏佐劑)、疫苗組和空白對照組。蛋白免疫組首免以肌肉注射30 μg OMPs(弗氏完全佐劑乳化)，間隔兩周以同樣方式和劑量二免(弗氏不完全佐劑乳化)；疫苗組注射等體積雞大腸桿菌蜂膠滅活疫苗，免疫程序同上；對照組以同樣的免疫程序注射等體積PBS (對應(yīng)弗氏佐劑乳化)。首免第48 d 后對3 組小鼠采用5 LD50(2×107cfu)E.coliEC-9 株攻毒，攻毒后觀察記錄每組小鼠死亡情況。

在小鼠初次免疫前及免疫后7 d、14 d、28 d、42 d 經(jīng)眼球脈絡(luò)叢采血，分離血清，于-20 ℃保存。以提取的E.coliOMPs 作為包被抗原，采用間接ELISA[11]檢測免疫小鼠特異性抗體效價，免疫組的血清OD450nm與空白對照組的陰性血清OD450nm的比值(P/N 值)小于2.0 為陰性，反之為陽性；采用MTT法[12]檢測免疫小鼠外周血T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；采用常規(guī)法[13]分析免疫器官脾臟指數(shù)。

1.6 OMPs 對雞的免疫效果評價 參照文獻(xiàn)[10]，選擇14 日齡海蘭褐雛雞105 只，隨機(jī)分成3 組，每組35 只。第1 組為空白組；第2 組為雞大腸桿菌蜂膠滅活疫苗，免疫劑量為0.2 mL/只(2.0×109cfu/mL)；第3 組為OMPs+不完全弗氏佐劑，免疫劑量為0.2 mL/只(含OMP 30 μg)；試驗(yàn)方案同方法1.5。同上，采用間接EILSA 法檢測雞特異性抗體效價、MTT 法檢測雞外周血T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，常規(guī)法分析免疫器官脾臟指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 OMPs 濃度測定及超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果 各菌株提取OMPs，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后測定其濃度。結(jié)果顯示，所測得的不同血清型的大腸桿菌地方流行株 OMPs 濃度在 1 026.632 μg/mL～1 715.589 μg/mL，這可能與大腸桿菌在LB 液體培養(yǎng)基生長快慢有關(guān)。將提取的OMPs 經(jīng)透射電鏡觀察，可見大腸桿菌OMPs 基本上呈雙層泡狀的C 形結(jié)構(gòu)，也有個別的呈雙層泡狀的O 形結(jié)構(gòu)(圖1)。大腸桿菌外膜之所以呈現(xiàn)多形性，可能是由于超聲波破碎細(xì)菌時被裂解造成的。

2.2 OMPs SDS-PAGE 和 western blot 鑒定 利用 SDS-PAGE 分析10 個菌株的OMPs 分子量，結(jié)果顯示，10 株菌的OMPs 在25 ku～55 ku 處有大小不等的條帶，其中以位于55 ku 的OMPs 含量最高。Western blot 鑒定結(jié)果顯示，10 個菌株的OMPs 均可與大腸桿菌陽性血清發(fā)生反應(yīng)(圖2)，表明雞致病性E.coli的OMPs 具有良好的反應(yīng)原性。

圖1 雞致病性大腸桿菌地方流行株OMPs 的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of Omps of endemic strains of avian pathogenic Escherichia coli

圖2 10 株地方流行致病性大腸桿菌OMPs 的SDS-PAG 檢測及western blot 分析Fig.2 Analysis of 10 endemic strains of pathogenic E.coli OMPs by SDS-PAGE (A) and western blot (B)

2.3 OMPs 免疫小鼠的效果評價 3 組小鼠省免疫48 d 后經(jīng)腹腔感染E.coliEC-9，結(jié)果顯示對照組小鼠全部死亡，蜂膠滅活疫苗組死亡4 只，OMPs 免疫組死亡2 只，其余小鼠經(jīng)過7 d 精神沉郁、食欲不振后逐漸恢復(fù)健康；E.coli蜂膠滅活疫苗免疫組保護(hù)率為60 %，OMPs 免疫組攻毒保護(hù)率為70 %(圖3A)，表明OMPs 對小鼠具有一定的保護(hù)力，且免疫保護(hù)力略好于市售蜂膠疫苗。將5 次采集的免疫小鼠血清進(jìn)行間接ELISA 檢測，結(jié)果顯示，兩種疫苗免疫小鼠后血清中的抗體水平均高于空白組，表明OMPs 和蜂膠疫苗組均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，OMPs 組抗體效價最高(1∶400) (圖3B)。結(jié)果表明，OMPs 能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。

OMPs 免疫小鼠后，MTT 試驗(yàn)結(jié)果顯示，OMPs組小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯高于空白對照組與蜂膠疫苗免疫組，最高達(dá)1.582 (圖3C)。通過測定其脾臟指數(shù)進(jìn)一步評估細(xì)胞免疫水平，結(jié)果顯示OMPs 免疫組小鼠的脾臟指數(shù)均高于蜂膠疫苗組，最高達(dá)5.334 (圖3D)。上述結(jié)果表明OMPs 能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖3 OMPs 免疫小鼠免疫保護(hù)效果(A)、血清中抗體(B)和T 淋巴細(xì)胞增值轉(zhuǎn)化水平(C)變化及脾臟指數(shù)消長(D)檢測結(jié)果Fig.3 Immunoprotective effects(A), Effect of spleen index (D) and changes of serum antibody levels(B) and T lymphocyte proliferation and transformation (C) in mice immunized with OMPs

2.4 OMPs 免疫雛雞的效果評價 3 組雛雞免疫后48 d 經(jīng)肌肉感染E.coliEC-9 菌株，結(jié)果顯示對照組雛雞全部死亡，疫苗組雛雞死亡8 只，OMPs 免疫組雛雞死亡4 只，其余雛雞經(jīng)過精神沉郁、食欲不振后逐漸恢復(fù)健康；E.coli蜂膠滅活疫苗組免疫保護(hù)率為60%，OMPs 免疫組免疫保護(hù)率為80%(圖4A)。結(jié)果表明OMPs 對雛雞具有良好的保護(hù)力。利用ELISA 方法檢測5 次采集的免疫雛雞血清抗體滴度，結(jié)果顯示兩種疫苗免疫組抗體水平均高于空白組，OMPs 免疫組的抗體水平(最高為1∶800)高于蜂膠疫苗免疫組(最高為 1∶400) (圖4B)，表明 OMPs 能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答。

OMPs 免疫后進(jìn)行MTT 試驗(yàn)，結(jié)果顯示OMPs免疫組雛雞的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯高于空白對照組與蜂膠疫苗免疫組，蜂膠組最高達(dá)1.693，OMPs 最高達(dá)2.215 (圖4C)，表明OMPs 能誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。OMPs 和蜂膠疫苗免疫組的雛雞脾臟指數(shù)均顯著高于空白組，最高達(dá)3.981 和3.683 (圖4D)。上述結(jié)果表明OMPs 能刺激誘導(dǎo)雛雞較強(qiáng)的細(xì)胞免疫水平，且效果優(yōu)于市售蜂膠疫苗組。

3 討 論

雞致病性E.coli擁有多種血清型，同一血清型中不同的菌株之間無交叉免疫保護(hù)性，尚無有效疫苗進(jìn)行預(yù)防，成為雞大腸桿菌病的廣泛流行的主要原因之一[14-15]。相關(guān)研究表明大腸桿菌的OMPs 具有免疫原性，并具有一定的免疫保護(hù)效果，但不同地區(qū)大腸桿菌OMPs 差異明顯，交叉保護(hù)效果較差，因此本研究選擇地方流行株OMPs 進(jìn)行侯選亞單位疫苗的研制[16]。

圖4 OMPs 免疫雛雞免疫保護(hù)效果(A)、血清中抗體(B)和T 淋巴細(xì)胞增值轉(zhuǎn)化水平變化(C)及脾臟指數(shù)消長檢測結(jié)果(D)Fig.4 Immunoprotective effects (A), Effect of Spleen Index (D) andchanges of serum antibody levels(B) and T lymphocyte proliferation and transformation (C) in chickens immunized with OMPs

國內(nèi)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌OMPs 通過負(fù)染后，在電鏡下觀察其形態(tài)，基本上呈現(xiàn)雙層泡狀結(jié)構(gòu)，大多數(shù)為O 形或C 形。程安春報道了傷寒桿菌的OMPs 負(fù)染后經(jīng)電鏡觀察，其形態(tài)基本上都是雙層泡狀結(jié)構(gòu)，多數(shù)為O 形或者C 形[16]。蘇敬良等在透射電鏡下觀察到的鴨疫里默氏桿菌的OMPs 大多數(shù)是圓形的雙層膜結(jié)構(gòu)，少數(shù)為C 形[17]。本研究觀察到的大腸桿菌OMPs 的形態(tài)結(jié)構(gòu)主要為C 形的雙層泡狀結(jié)構(gòu)，少數(shù)呈O 形，與之前報道的結(jié)果基本一致。

傳統(tǒng)的大腸桿菌全菌體菌苗、單一蛋白抗原組成的亞單位疫苗的疫苗效力和保護(hù)能力有限，但OMPs 是多種具有免疫保護(hù)效果的蛋白混合體，可刺激免疫動物產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)效果[18-19]。Udhayakumar 等報道從光滑(C5)和粗糙(Rb2)鼠傷寒沙門氏菌菌株中提取的OMPs 能夠誘導(dǎo)對沙門氏菌病的保護(hù)性免疫，保護(hù)持續(xù)至少6 個月[20]。徐晶等發(fā)現(xiàn)壞死梭桿菌 OMPs 經(jīng) SDS-PAGE、western blot 和接種小鼠病理學(xué)檢測分析表明其具有良好的免疫原性[8]。E.coliOMPs 的基因表達(dá)在調(diào)節(jié)E.coli的免疫機(jī)能和毒力島致病性等方面起著關(guān)鍵性作用[21]。李曉霞等證實(shí)了腸致病性大腸桿菌OMPs 可以誘導(dǎo)兔對大腸桿菌的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高免疫血清中抗OMP 的抗體效價和體外脾淋巴細(xì)胞特異性增殖反應(yīng)，且對大腸桿菌感染具有一定的抵抗力[13]。本研究也證實(shí)了雞源E.coli地方流行株的OMPs 能刺激小鼠和雛雞機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，對小鼠和雛雞產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，保護(hù)率明顯高于蜂膠疫苗組。與張彥明等報道的用不同OMP型的大腸桿菌菌株制備融合菌株疫苗免疫雛雞，對雛雞保護(hù)率均高于O 血清型單價疫苗和雙價疫苗一致[22]。由于E.coli具有多種O 血清型，O 血清型單價或者多價疫苗只對同種血清型親本株具有保護(hù)作用，對其它血清型非親本株無交叉保護(hù)性[22-24]。本實(shí)驗(yàn)選用的雞大腸桿菌蜂膠滅活疫苗為多價疫苗(血清型O1、O2、O78)，雞大腸桿菌蜂膠滅活疫苗和OMPs 弗氏佐劑疫苗均能提高機(jī)體的免疫機(jī)能，從動物攻毒保護(hù)試驗(yàn)可知OMPs 弗氏佐劑疫苗保護(hù)率高于雞大腸桿菌蜂膠滅活疫苗，可能由于攻毒的菌株血清型為O89/O78，而雞大腸桿菌蜂膠滅活疫苗只對同種血清型親本株具有能保護(hù)作用，對其它血清型非親本株缺少交叉保護(hù)作用所致。王文豪等[25]發(fā)現(xiàn)豬致病性大腸桿菌OMPs 亞單位疫苗對不同菌株均具有交叉免疫保護(hù)力，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。然而如何使OMPs 亞單位疫苗形成規(guī)?；a(chǎn)，并充分發(fā)揮其良好的免疫效果，還有待進(jìn)一步研究。