葉 俊，布日額*，吳金花，錫林高娃，陳金龍，王金良，劉思國，崔子寅，王思珍

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028043；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028043；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古通遼028043；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)乳源性致病菌研究所，內(nèi)蒙古通遼028043；5.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；6.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江哈爾濱150069)

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis，TB)是由牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis，MB)引起的一種慢性、消耗性、終身感染性疫病[1-2]。TB 主要由牛分枝桿菌引起，人類結(jié)核病約10 %以上是由牛分枝桿菌引起。該疫病的特征是潛伏期較長，一般在數(shù)月至數(shù)年，而且往往癥狀不典型，具有反復(fù)發(fā)作的特征[3-4]。MB 對人畜危害極大，中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)于2014 年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料顯示，我國結(jié)核病年發(fā)病例約為100 萬例，年死亡病例為5.4 萬例，其中每年新發(fā)耐多藥結(jié)核桿菌患者約10 萬例[5-6]。這一調(diào)查結(jié)果提示，有效防控人畜結(jié)核病迫在眉睫，快速檢測技術(shù)產(chǎn)品將有巨大的需求和市場。

迄今為止，MB 的檢測主要采用細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)及抗酸染色等方法；免疫學(xué)方法有結(jié)核菌素(PPD)介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)；分子生物學(xué)方法常用的是PCR 檢測等[7-9]。這些方法均存在程度不等的缺陷和不足。傳統(tǒng)MB 的分離、培養(yǎng)、鑒定、檢測方法耗時(30 d～40 d)，靈敏度差，人為誤差大；結(jié)核菌素(PPD)介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)在分枝桿菌之間存在免疫交叉反應(yīng)；PCR 方法費時(2 d)，實驗空間和儀器依賴性強(qiáng)，這些方法無法滿足MB 的臨床快速檢測[10]。免疫膠體金技術(shù)具有方便、快速，適合在基層和養(yǎng)殖現(xiàn)場開展MB 的臨床快速檢測。MAb 的高靈敏度，強(qiáng)特異性使得免疫膠體金技術(shù)在快速鑒定病原體及準(zhǔn)確診斷感染性疾病方面將發(fā)揮不可替代的作用。因此，制備MB 早期診斷的MAb，并建立相應(yīng)的膠體金快速檢測技術(shù)具有很好的應(yīng)用和推廣價值。

MB 在增殖過程中分泌多種胞外分泌蛋白[11-12]，其中MPB70 和MPB83 是MB 兩種同源的分泌蛋白，為早期標(biāo)識性分泌性蛋白。MPB70 蛋白具有高度可溶性，研究表明，此蛋白具有作為MB 感染的診斷靶位抗原的可行性。MPB83 蛋白是MB 菌體表面一種特異性的糖脂蛋白，也可以刺激機(jī)體產(chǎn)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[13-14]。本研究將MPB70 和MPB83 基因融合表達(dá)，純化并制備其MAb，將制備的MAb經(jīng)膠體金標(biāo)記后初步建立了早期檢測MB 的膠體金免疫層析技術(shù)，為防控牛結(jié)核分枝桿菌病提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及實驗動物 MB 核酸及培養(yǎng)物上清為哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；pMD18-T 克隆載體、DH5α 和BL21 工程菌即用型感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司；pET28a(+)原核表達(dá)載體、SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞、pGEX-6p-1-MPB70+83重組質(zhì)粒、臨床結(jié)核分枝桿菌陽性血清、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、無乳鏈球菌、副結(jié)核桿菌均由本實驗室保存；BALB/c 小鼠購自濟(jì)南市金豐實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 10×PCR Buffer、dNTP、高保真DNA 聚 合 酶 、DL2000 DNA Marker、T4 DNA Ligase、NdeⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶均為NEB 公司產(chǎn)品；硫酸卡那霉素、IPTG、His 標(biāo)簽蛋白親和層析填料等均購自北京索萊寶科技有限公司；羊抗鼠IgG-HRP 購自 Sigma 公司；MAb 亞類鑒定 ELISA 試劑盒購自上海士峰生物科技有限公司。低分子量蛋白Marker、HAT、PEG1500、胎牛血清等為Thermo公司產(chǎn)品。

1.3 MPB70+83融合基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過Prime5 生物信息軟件分析，根據(jù)本實驗室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-MPB70+83中的MPB70和MPB83融合基因序列，設(shè)計一對引物：MPB70F：5'-GGGA ATTCCATATGGCAGGCGATCTGGTG-3'/MPB83R：5'-TTGCTCGAGCATGAGGTCGTCGCGG-3'。以pGE X-6p-1-MPB70+83重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增 MPB70和MPB83融合基因 MPB70+83。PCR 產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切回收并與酶切后的pET28a(+)原核表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET28a(+)-MPB70+83。經(jīng)雙酶切鑒定的陽性克隆由生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.4 重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化 將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-MPB70+83轉(zhuǎn)化至BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃振搖培養(yǎng)至OD600nm約為0.8 時加入終濃度為1.0 mmol/LIPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，對表達(dá)產(chǎn)物MPB70+83重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 檢測、His 親和填料純化，對純化蛋白采用BCA 法測定濃度。

1.5 抗MPB70+83重組蛋白MAb 的制備

1.5.1 小鼠免疫與融合篩選 選擇 4 只 SPF 級BALB/c 小鼠，以50 μg/只純化的MPB70+83重組蛋白與等量弗氏完全佐劑乳化后皮下注射首免，然后在首免后14 d、28 d、42 d 各進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，每次每只50 μg 抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化混勻。采血檢測小鼠血清效價，當(dāng)效價達(dá)到1∶10 000 以上時用100 μg MPB70+83抗原尾靜脈沖擊免疫，49 d 采血測效價并無菌采集小鼠脾細(xì)胞，加入少量HAT備用。收集培養(yǎng)好的骨髓瘤細(xì)胞并反復(fù)洗滌3 次，將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法融合培養(yǎng)，得細(xì)胞長滿孔底時用間接ELISA 方法篩選，一抗為1∶200倍稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)物上清，二抗為1∶5 000 倍稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，檢測為陽性的雜交瘤細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行3～5 輪亞克隆，將篩選出的陽性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 MAb 的制備與純化 首先向小鼠腹腔注入弗氏佐劑致敏，7 d 后每只小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞誘生腹水，9 d 后收集腹水并離心去除腹水中的細(xì)胞和油脂，用硫酸銨沉淀法及親和層析法提取腹水中的MAb，透析濃縮后Bradford 測定濃度。

1.6 MAb 的鑒定 將腹水按照 1∶1 600～1∶51 200倍比稀釋，間接ELISA 檢測腹水效價，一抗為1 ∶1 600～1∶51 200 倍比稀釋的腹水，二抗為 1∶5 000倍稀釋的羊抗鼠IgG。將MAb 細(xì)胞株連續(xù)傳代15次，分別取第1 代和第15 代細(xì)胞上清，采用上述間接ELISA 方法檢測MAb 效價，比較其穩(wěn)定性。使用MAb 亞類鑒定ELISA 試劑盒對獲得的MAb 進(jìn)行亞型鑒定。

1.7 MAb 的膠體金標(biāo)記及測試 使用膠體金標(biāo)記抗體效價較高的MAb，抗體標(biāo)記濃度為6 μg/mL 金液，標(biāo)記pH 值8.0，膠體金封閉液為10 % BSA，利用另一MAb 噴涂檢測線，檢測線抗體噴涂濃度為1 mg/mL，質(zhì)控線噴涂濃度為1.5 mg/mL 的羊抗鼠IgG，具體標(biāo)記步驟參考文獻(xiàn)[15]。

采用制備的膠體金試紙分別檢測以MB 培養(yǎng)上清人工誘染的健康牛血清(MB 培養(yǎng)上清與健康奶牛血清體積比為1∶10)，以及以無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、副結(jié)核桿菌培養(yǎng)物人工污染的健康牛血清(健康牛血清中加入細(xì)菌的個數(shù)約為1×108cfu/mL)，檢測該試紙條的特異性。

分別以 1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶3 500、1∶4 000 稀釋的 MB 培養(yǎng)上清為實驗組，采用制備的膠體金試紙進(jìn)行靈敏度測試。

2 結(jié) 果

2.1 MPB70+83融合基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以pGEX-6p-1-MPB70+83重組質(zhì)粒為模板，以MPB70F/MPB83R 為引物，PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示得到約1 000 bp 的目的條帶，與預(yù)期MPB70+83融合基因片段相符(圖1)。將其克隆至pET28a(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-MPB70+83，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切后結(jié)果顯示，出現(xiàn)約1 000 bp 和5 000 bp兩條帶(圖1)，重組質(zhì)粒經(jīng)測序，結(jié)果顯示MPB70+83融合基因無堿基突變和缺失，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 MPB70+83 融合基因的PCR 擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Amplification of MPB70 and MPB83 fusion genes and identification recombinant plasmids by double enzyme digestion

2.2 重組基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化 將pET28a(+)-MPB70+83轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后SDS-PAGE 電泳檢測，結(jié)果顯示在約40 ku 處出現(xiàn)目的條帶，目的蛋白主要存在于包涵體中，經(jīng)變性、復(fù)性及His 填料親和層析純化后，BCA 法測定蛋白含量為1.2 mg/mL，SDS-PAGE 電泳顯示純化蛋白純度＞95 % (圖2)。

圖2 MPB70+83 重組蛋白表達(dá)及純化結(jié)果Fig.2 Expression and purification of MPB70+83 recombinant protein

2.3 抗MPB70+83重組蛋白MAb 的制備 融合細(xì)胞經(jīng)多次克隆純化及篩選，結(jié)果得到了3 株穩(wěn)定的抗MPB70+83重組蛋白 MAb，分別命名為 4H6、5A2、4D11 (圖3)。純化后的3 株MAb 經(jīng)透析濃縮后測定其濃度，分別為3.51mg/mL、3.56mg/mL、4.32mg/mL。

圖3 MAb 的 SDS-PAGE 鑒定圖Fig.3 SDS-PAGE of purified MAb

2.4 MAb 的鑒定 MAb 的效價鑒定結(jié)果顯示，4H6、5A2、4D11 的效價分別為 1∶12 800、1∶12 800、1∶25 600。MAb 雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性鑒定結(jié)果顯示，4H6、5A2、4D11 細(xì)胞培養(yǎng)上清(F1)的效價分別為 1∶1 024、1∶1 024、1∶2 048。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳至15 代(F15)時，其培養(yǎng)上清效價仍然穩(wěn)定(圖4)。MAb 亞型鑒定結(jié)果顯示，該3 株MAb 均屬于IgG1亞類(表1)。

圖4 4H6、5A2、4D11 雜效瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清F1 代與F15 代效價比較Fig.4 Comparison of the titers of F1 and F15 supernatants of 4H6,5A2 and 4D11 cell cultures

表1 間接ELISA 法測定單克隆抗體的亞型Table 1 Indirect ELISA for the determination of subtypes of monoclonal antibodies

2.5 膠體金試紙的初步測試 根據(jù)以上試驗結(jié)果選擇4DH MAb 利用膠體金標(biāo)記，4H6 MAb 噴涂檢測線，制備膠體金試紙條。特異性檢測結(jié)果顯示制備的膠體金試紙與人工污染無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、副結(jié)核桿菌培養(yǎng)物的健康牛血清均無反應(yīng)，與人工污染MB 上清的健康牛血清為陽性反應(yīng)(圖5)。表明該試紙條具有較強(qiáng)的特異性。

圖5 膠體金試紙條特異性試驗結(jié)果Fig.5 Specificity analysis of colloidal gold strip

靈敏度測試結(jié)果顯示，制備的膠體金試紙條最低可以檢測 1∶2 500 倍稀釋的 MB 培養(yǎng)上清(圖6)。表明該試紙條具有較高的靈敏度。

圖6 膠體金試紙條靈敏度試驗結(jié)果Fig.6 Sensitivity analysis of colloidal gold strip

3 討 論

MB 感染機(jī)體后潛伏期長短不一，通常為15 d以上，有的甚至長達(dá)幾個月。MB 在侵入機(jī)體過程中會分泌 ESAT-6 系列、Hsp65、Ag85、MPB70、MPB83 等分泌性蛋白，導(dǎo)致動物機(jī)體產(chǎn)生一系列的細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)。國內(nèi)已有學(xué)者利用這些單個早期標(biāo)識物制備MAb，如游璇等于2017 年報道，制備了MB 分泌性蛋白ESAT-6 特定抗原肽序列的MAb，并證明制備的MAb 可用于結(jié)核病的早期診斷[16]；馬榮等于2015 年對結(jié)核桿菌MPB64 抗原進(jìn)行了表達(dá)、純化并制備和獲得了抗MPB64 MAb 的細(xì)胞株[17]；何俊杰于2010 年構(gòu)建表達(dá)MTB H37RV 保 護(hù) 性 抗 原 Ag85B、 Ag85B-ESAT6 和ESAT6-RPFD 的原核表達(dá)載體，表達(dá)、純化了3 種蛋白，并制備了抗Ag85B 蛋白的MAb[18]。但是利用復(fù)合抗原制備MAb 的研究較少。

本研究在綜合分析MB 早期標(biāo)識性分泌性蛋白MPB70 與MPB83 抗原性基礎(chǔ)上，構(gòu)建MPB70+83融合基因，并進(jìn)行了表達(dá)、純化、小鼠免疫、細(xì)胞融合篩選、MAb 的制備及膠體金試紙條的初步制備。在MAb 制備雜交瘤細(xì)胞篩選過程中，本研究免疫使用的是帶有His 標(biāo)簽的重組蛋白，篩選時使用的是帶GST 標(biāo)簽的重組蛋白，最終篩選出效價較好的3 株陽性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4H6、5A2、4D11，這3 株MAb 細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)15 代后其培養(yǎng)上清效價依然穩(wěn)定，制備的腹水效價最高達(dá)1∶25 600，制備的膠體金試紙最低可以檢測1∶2 500 稀釋后的MB培養(yǎng)上清，且與人工培養(yǎng)的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、副結(jié)核桿菌等均無交叉反應(yīng)，表明制備的膠體金試紙條具有較強(qiáng)的特異性與較高靈敏度，由于該技術(shù)的檢測目標(biāo)物是結(jié)核分枝桿菌早期感染的標(biāo)識物，此時機(jī)體尚未產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)抗體，由于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗僅能檢測出部分產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)抗體的個體，因此該方法有可能適合MB 感染的早期篩查預(yù)警，這將為結(jié)核分枝桿菌病皮試陽性牛群中篩查感染早期的患牛提供新的技術(shù)手段。