時 行，曹玉珠 ，丁語石，祝娉婷，李曉曼, 2，吳媛媛, 2，陳文星, 2，王愛云, 2，陸 茵, 2

(1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2. 南京中醫(yī)藥大學江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

腸道微生物組在慢性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用不斷被闡明，研究顯示，從非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)，肝硬化到肝細胞癌(hepatocellular cancer，HCC)等多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展都與腸道微生物的“功能失調”存在緊密聯(lián)系。由于肝臟通過門靜脈直接接收攜帶微生物的腸道的大部分血液供應，因此腸道微生物組和肝臟本質上緊密相連。使用非培養(yǎng)技術允許在短時間內(nèi)對整個微生物群進行測序，例如16s rRNA測序和宏基因組分析等，這些技術的出現(xiàn)使研究人員能夠解析腸道微生物對多種不同疾病的影響。本文將詳盡總結腸道微生物在慢性肝病發(fā)病機制和進展中的作用，并闡述調節(jié)腸道微生物作為肝病治療的潛在靶點及其作用機制。

1 腸道微生物群在慢性肝病中的作用及其機制

1.1 非酒精脂肪性肝非酒精性脂肪肝病可大致分為兩類：非酒精性脂肪肝(NAFLD的非進展性形式)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)(NAFLD的進展形式)，NASH可能進一步發(fā)展成為肝硬化或者肝細胞癌[1]。NASH通常與2型糖尿病，心血管危險因素和肥胖有關。研究發(fā)現(xiàn)[2]，NAFLD患者會出現(xiàn)小腸細菌過度生長以及腸道生態(tài)失調的現(xiàn)象。越來越多的研究證實，NAFLD與腸道微生物群之間的緊密關聯(lián)，這也使得腸道微生物可能成為NAFLD早期診斷的潛在標志物。Boursier等[3]對NASH患者與沒有NASH的患者腸道微生物群進行比較，發(fā)現(xiàn)NASH患者腸道微生物群的擬桿菌屬(Bacteroides)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)豐度明顯增加，普氏菌屬(Prevotella)豐度相對減少。Loomba等[4]通過宏基因組學分析合并纖維化(3期和4期纖維化)的NAFLD患者腸道微生物的改變，結果顯示合并纖維化的NAFLD患者的大腸桿菌(Escherichia coli)和普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)豐度明顯增加。Zhu等[5]研究了健康兒童、NASH兒童和肝臟生化正常的肥胖兒童的腸道微生物，發(fā)現(xiàn)肥胖兒童和NASH患兒的擬桿菌門(Bacteroidetes)水平明顯增加，同時伴隨厚壁菌門(Firmicutes)水平的減少。此外，變形菌門(Proteobacteria)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和埃希桿菌屬(Escherichia)在健康兒童和肥胖兒童中水平相近，但在NASH患者中明顯升高。

遺傳修飾的小鼠模型已被用于研究NAFLD相關的腸道生態(tài)失調，Rahman等[6]使用連接黏附分子1(junctional adhesion molecule 1，Jam-1)敲除小鼠證明了Jam-1缺失后，食用富含飽和脂肪、果糖和膽固醇的飲食會導致腸道通透性增加，并且會加重肝臟炎癥。有趣的是，通過給予抗生素可以緩解這種炎癥，這表明腸道微生物移位可能在促進肝臟免疫應答中發(fā)揮著重要的作用。另一項研究發(fā)現(xiàn)，黏蛋白-2(mucin-2，Muc-2)缺乏的小鼠出現(xiàn)腸道抗微生物蛋白編碼基因Reg3b和Reg3g代償性增加的現(xiàn)象，而這會引起針對NAFLD的保護性免疫應答[7]。

1.2 酒精性肝病作為臨床典型的慢性疾病，ALD也與腸道微生物失衡有著緊密的聯(lián)系，長期酒精攝入會造成腸道微生物數(shù)量變化、菌群移位以及腸道通透性改變，最終激活機體免疫應答，促進肝臟炎癥。因此腸道微生物成為影響酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的重要因素[8-9]。

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)是最常見的酒精性肝病。Llopis等[10]已證實AH與腸道生態(tài)失調有關，其研究發(fā)現(xiàn)AH患者比沒有AH的飲酒患者腸道中攜帶更多的雙歧桿菌(Bifidobacteria)和鏈球菌(Streptococci)。并且腸桿菌(Enterobacteria)和鏈球菌(Streptococci)與AH發(fā)展呈正相關性。而奇異菌屬(Atopobium)和柔嫩梭菌(Clostridium leptum)兩種抗炎腸道細菌與血液膽紅素的升高以及肝纖維化的發(fā)展呈負相關。研究人員將AH飲酒患者的腸道微生物移植到無菌小鼠，并將給予來自非AH患者的腸道微生物的無菌小鼠作為對照組。結果顯示，與非AH患者微生物處理的小鼠相比，AH患者微生物處理的小鼠肝臟發(fā)生了明顯的炎性病變、腸道滲透性明顯增加并且出現(xiàn)腸道微生物組移位的現(xiàn)象。這可能與AH微生物處理的小鼠腸道出現(xiàn)Muc2表達減少有關[10]。此外，研究發(fā)現(xiàn)酒精還與產(chǎn)生內(nèi)毒素的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)豐度的相對增加以及產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌群減少有關[11]。Ferrere等[12]檢測了酒精對腸道微生物組的影響，觀察到某些小鼠對酒精具有抵抗力，而其他小鼠對酒精敏感，其最終可導致酒精相關病變的發(fā)展，例如脂肪變性。其中，酒精敏感的小鼠腸道放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)水平增加，擬桿菌門(Bacteroidetes)比酒精抵抗小鼠少50%。當將酒精耐受小鼠糞便移植到酒精敏感小鼠時，可以有效防止酒精誘導的擬桿菌消耗以及脂肪變性的發(fā)展。

除了腸道細菌豐度的改變外，有研究顯示，酒精會改變腸道真菌的組成。Yang等[13]發(fā)現(xiàn)酒精能誘發(fā)小鼠腸道真菌的過度生長。β-葡聚糖是真菌細胞壁的一種成分，在暴露于酒精的小鼠的體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)。而用兩性霉素B治療能夠減少真菌多樣性和念珠菌屬的過度生長，降低β-葡聚糖的轉運并且改善酒精性肝臟疾病。

1.3 原發(fā)性硬化性膽管炎原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)是一種慢性特發(fā)性膽汁淤積性肝病，其特征在于膽管的進行性炎癥和纖維化。原發(fā)性硬化性膽管炎與炎癥性腸病緊密相關，尤其是潰瘍性結腸炎。Sabino等[14]將來自PSC患者的糞便樣品與健康人群或炎癥性腸病患者的糞便細菌成分進行比較，發(fā)現(xiàn)腸球菌屬(Enterococcus)，梭桿菌屬(Fusobacterium)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在PSC中豐度增加，同時伴隨著細菌多樣性的降低。與疾病穩(wěn)定的患者相比，這些變化在肝硬化和既往肝移植患者中最為明顯。Rossen等[15]對黏膜相關細菌的分析也發(fā)現(xiàn)PSC患者的腸道細菌多樣性較低。此外，也有一些研究證實腸道微生物群直接參與PSC的發(fā)病過程，Mueller等[16]研究發(fā)現(xiàn)，細菌過度生長的動物肝臟出現(xiàn)PSC樣病變，并且這種改變可以通過抗生素來逆轉。通過培養(yǎng)PSC患者的膽管細胞，發(fā)現(xiàn)其對病原相關分子模式的敏感性明顯增加，例如脂多糖。

1.4 肝細胞癌越來越多的證據(jù)表明，HCC常常伴隨著腸道生態(tài)失調，如腸屏障功能障礙、細菌移位、腫瘤促進代謝物的全身循環(huán)。已有研究發(fā)現(xiàn)在肥胖誘導的HCC小鼠模型中梭菌屬(Clostridium)的富集，而臨床HCC患者的中腸道大腸桿菌(Escherichia coli)過度生長。Grat等[17]對15例接受移植治療的肝硬化患者與15例進行移植治療同時，具有肝硬化和肝癌的患者進行前瞻性地評估，將移植治療前期所有HCC患者的腸道微生物與沒有HCC的肝硬化患者的腸道微生物相比對，發(fā)現(xiàn)HCC患者的大腸桿菌(E.coli)水平明顯增加。這些結果表明，大腸桿菌在HCC發(fā)生中具有潛在的作用。此外，也有研究報道人和小鼠HCC模型中存在螺桿菌屬(Helicobacter)向腫瘤組織遷移的現(xiàn)象。值得注意的是，已有研究表明，該菌屬能夠通過激活NF-κB和Wnt信號傳導并抑制抗腫瘤免疫來促進HCC的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，腸道多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor，PIGR)能夠調節(jié)IgA向腸腔的轉運并維持微生物群的穩(wěn)態(tài)。Shalapour等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在NASH誘導PIGR敲除小鼠的HCC模型中，全身和肝臟IgA水平升高以及肝臟腫瘤發(fā)生率增加。此外，廣譜抗生素(如氨芐青霉素和阿莫西林)的應用已被證明可減輕小鼠的肝臟炎癥和HCC發(fā)展，這證明了腸道微生物在肝臟腫瘤發(fā)生中的作用。在另一種由二乙基亞硝胺(一種致癌物質)誘導HCC的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)了由脂多糖移位引起的TLR4活化，繼而上調肝星狀細胞中的肝表皮調節(jié)素水平，并激活NF-κB通路，進而誘發(fā)了腫瘤細胞增殖[19]。

2 針對慢性肝病的腸道微生物的治療策略

2.1 抗生素抗生素具有減少腸道中細菌總數(shù)以及減少細菌移位的作用，從而抑制由腸道泄漏引起的促炎信號的激活。諾氟沙星是一種喹諾酮類藥物，主要作為高危肝硬化患者自發(fā)性細菌性腹膜炎和感染的一級或二級預防藥物。晚期肝硬化患者的臨床試驗表明，長期使用口服諾氟沙星是安全的，其能使糞便微生物中的革蘭陰性菌明顯減少。降低自發(fā)性細菌性腹膜炎和肝腎綜合征1年再發(fā)生的概率，并提高患者生存率。利福昔明是一種具有廣譜抗菌活性的抗生素，除了抗生素的典型殺菌和抑菌活性外，其還可發(fā)揮通過調節(jié)微生物組成而發(fā)揮降低內(nèi)毒素和抗炎作用[20]。在早期臨床試驗中，利福昔明(1 200 mg· d-1)短期治療已被證明，能夠改善NAFLD / NASH患者內(nèi)毒素血癥和降低轉氨酶[21]。利福昔明也可減少自發(fā)性細菌性腹膜炎的發(fā)展，并且可以改善門靜脈高壓，這表明它能有效地針對晚期肝病的腸道微生物。與諾氟沙星相似，在一些研究中已發(fā)現(xiàn)利福昔明可提高晚期肝硬化患者的生存率[22]。此外，不斷有研究證明，通過抗生素調節(jié)腸道微生物對HCC的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響。研究顯示，通過由氨芐青霉素、新霉素、甲硝唑和萬古霉素組成的口服抗生素混合物進行連續(xù)腸道滅菌能夠有效地減少小鼠中由二乙基亞硝胺(diethylmitrosamine, DEN)/CCl4或二甲基苯蒽聯(lián)合高脂誘導的HCC腫瘤的數(shù)量和體積。

2.2 益生菌在慢性肝病中，益生菌被用來恢復有益細菌來重新平衡腸道微生物群。已有大量研究證明，益生菌治療肝臟疾病的有效性。一項隨機試驗顯示，連續(xù)4個月補充VSL#3可改善兒童NAFLD，其作用機制包括調節(jié)宿主微生物、改善腸屏障功能和調節(jié)免疫系統(tǒng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在ALD的小鼠模型中，給予艾克曼菌(A.muciniphila)能夠改善酒精相關的肝損傷和腸屏障功能[24]。在DEN誘導的肝癌模型中，采用VSL#3(含有嗜熱鏈球菌，短雙歧桿菌，長雙歧桿菌，嬰兒雙歧桿菌，嗜酸乳桿菌，植物乳桿菌，副干酪乳桿菌，德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌)能夠減輕腸道生態(tài)失調，并且改善腸道炎癥[23]。在小鼠皮下移植瘤模型中，使用抗生素組合Prohep能夠減少腫瘤的體積和重量[25]。

2.3 糞便菌群移植糞便菌群移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是將含有健康個體的細菌糞便物質移植到接受者的過程。近年來，F(xiàn)MT已經(jīng)被越來越多的應用研究，F(xiàn)MT的機制可能涉及有益細菌菌株的建立和抗微生物組分的產(chǎn)生。Ferrere等[12]將來自酒精抵抗小鼠的糞便移植到酒精敏感的受體小鼠中，每周3次，持續(xù)3周，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT能夠預防酒精誘導的腸道失調和肝臟脂肪性肝炎。FMT已成功用于治療艱難梭菌(C. difficile)感染的患者，其能促進恢復腸道生態(tài)平衡，并且臨床改善效果優(yōu)于標準抗生素治療。FMT具有重新恢復整個益生菌腸道環(huán)境的優(yōu)勢，但最佳給藥途徑、治療持續(xù)時間、反應持久性仍有待確定進一步探索。

3 展望

現(xiàn)有的大量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，NAFLD、ALD和PSC與腸道微生物“功能失調”具有緊密的相關性。晚期肝病與病原菌和小腸細菌過度生長存在正相關，而腸道通透性的改變，引發(fā)內(nèi)毒素和細菌移位進入門靜脈循環(huán)，會導致免疫激活和最終的肝損傷以及全身性炎癥。已有研究顯示，通過飲食改變和不可吸收的抗生素(如利福昔明)治療可以實現(xiàn)改善生態(tài)失調或“再生”，但在細菌多藥耐藥的時代，迫切需要開發(fā)不使用抗生素調節(jié)微生物群的新療法。有趣的是，相關證據(jù)表明，不是單種優(yōu)勢生物對宿主健康負責，而是整個微生物群落的組成有助于平衡免疫反應。宿主發(fā)展了許多機制來平衡腸道微生物群落結構的變化。這對未來治療方法的發(fā)展具有重要意義，這些療法不僅僅是引入單一生物體來改善健康，它意味著我們必須確定在發(fā)生生態(tài)失調后，重新構建健康的復雜微生物組的機制，將是治療慢性肝病的基礎。因此，最終治療可能涉及，將被視為健康的腸道微生物從非肥胖健康供體移植到患有慢性肝病的患者。已有研究顯示，通過益生菌療法或最終以FMT形式的整個微生物群移植，來實現(xiàn)無藥物的微生物群的直接操作，可能有效緩解慢性肝病的發(fā)生發(fā)展。