陳靜坤，葉展超，鄭曉輝，張錦雀

(1. 廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔科，福建 廈門 361000；2. 廈門醫(yī)學(xué)院機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361023；3. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，福建 福州 351004)

黏附調(diào)節(jié)分子1(adhesion regulating molecule 1，ADRM1)亦被稱為 hRpnl3(human Rpn13)，是26S蛋白酶體亞單位19S調(diào)節(jié)顆粒上的主要泛素受體之一，決定26S蛋白酶體結(jié)構(gòu)不對(duì)稱性。ADRM1介導(dǎo)的蛋白酶體泛素化路徑介導(dǎo)NF-κB、TGF-βI型受體、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等底物蛋白降解[1]。研究表明[2-5]，ADRM1在結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、肝癌等多種實(shí)體瘤和急性白血病中均處于過(guò)表達(dá)狀態(tài)，下調(diào) ADRM1蛋白表達(dá)可明顯促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。 因此，ADRM1可能成為腫瘤治療靶點(diǎn)。有研究表明[2, 6-11]，雙亞芐基哌啶RA190可與ADRM1的半胱氨酸88共價(jià)結(jié)合，快速觸發(fā)多泛素蛋白累積，誘導(dǎo)對(duì)硼替佐米耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡，也抑制卵巢癌、肝癌、肝內(nèi)膽管癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖；也有大量研究報(bào)道蛋白酶體抑制劑MG132通過(guò)抑制泛素蛋白酶體途徑活性，誘導(dǎo)肺癌[12]、Burkitt淋巴瘤[13]、急性髓系白血病[4]、肝癌、結(jié)直腸癌[14]等癌細(xì)胞凋亡；協(xié)同全反式維甲酸誘導(dǎo)GTF2I-RARA融合基因陽(yáng)性的HL60細(xì)胞分化[15]。

那么，RA190與MG132在舌癌細(xì)胞中作用效果如何呢？本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察舌癌細(xì)胞株CAL27和TCA8113在RA190或MG132藥物作用下存活率變化及周期與凋亡情況，比較這兩種藥物對(duì)舌癌細(xì)胞的毒性作用及作用機(jī)制，為臨床治療舌癌藥物選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 舌癌細(xì)胞株CAL27、TCA8113為福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。

1.1.2試劑 MG132(Cat. No. HY-13259)結(jié)構(gòu)見Fig 1、RA190(Cat. No. HY-100739)結(jié)構(gòu)見Fig 2、CCK8(Cat. No. MA0218)(MCE，中國(guó))，ADRM1(Cat. No.12019)、Cyclin B1(Cat. No.12231)、Bak(Cat. No.6947)、Bax(Cat. No. 5023)蛋白Western blot用一抗體(CST，美國(guó))，DMEM、D-hanks、PBS(Corning，美國(guó))，胰酶(Gibigo，美國(guó))，胎牛血清(Cat. No.900-108，Gemini，南美)，PI(KeyGEN Biotech，中國(guó))；Annexin V FLUOS Staining Kit(Cat. No. 11858777001，Roche，德國(guó))。

Fig 1 Chemical structure of RA190

Fig 2 Chemical structure of MG132

1.1.3儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱2323-2(SHELLAB公司)；倒置顯微鏡37XA(上海光學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(Bio-rad公司)；流式細(xì)胞儀EPICSXL(貝克曼庫(kù)爾特公司)；電泳儀PowerPac HC(Bio-Rad公司)；快速Western blot儀器MA01821(Millipore)；垂直電泳槽VE-180(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞增殖/毒性實(shí)驗(yàn) 設(shè)(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1)不同濃度RA190或MG132實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組(無(wú)藥)和空白組(不含細(xì)胞)。在96孔板中接種100 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度2×108·L-1)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)基，向每孔加入100 μL含不同濃度RA190或MG132的完全培養(yǎng)基，孵育24h；每孔加入10 μL CCK-8 ，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450/630 nm處的吸光度。繪制曲線。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 6孔板中接種2 mL細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度5×108·L-1)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)基，向每孔加入2 mL含不同濃度RA190或MG132的完全培養(yǎng)基，孵育24h后，收集細(xì)胞于5 mL PBS中，800 r·min-1離心5 min， 棄上清，預(yù)冷的PBS洗2次，300 μL預(yù)冷的PBS重懸沉淀后，吸取700 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇逐滴滴入重懸液中，置-20℃固定過(guò)夜，之后按PI說(shuō)明書操作。

1.2.3Annexin V FLUOS Staining Kit流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用Annexin V FLUOS Staining Kit檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞加藥及收集步驟同“1.2.2”，之后按說(shuō)明書操作。

1.2.4Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) 細(xì)胞加藥培養(yǎng)步驟同“1.2.2”，收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正釩酸鈉、10 mg·L-1抑肽酶)提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取40 μg總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。10% SDS-PAGE電泳后，行轉(zhuǎn)膜印跡，分別用β-actin、ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak一抗體與膜上的抗原結(jié)合，然后用HRP偶聯(lián)的二抗與其反應(yīng)，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)，經(jīng)壓片曝光后，顯影和定影。比較各組蛋白表達(dá)情況。設(shè)2個(gè)復(fù)孔，不同時(shí)間獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 RA190或MG132對(duì)舌癌細(xì)胞存活率的影響以細(xì)胞濃度2×108·L-1種板，CCK-8法酶標(biāo)儀檢測(cè)RA190或MG132 (0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μmol·L-1)作用24 h后舌癌細(xì)胞CAL27、TCA8113的OD450/630值。設(shè)3個(gè)復(fù)孔，不同時(shí)間獨(dú)立重復(fù)3次。如Fig 3所示，隨著MG132濃度提高，CAL27、TCA8113細(xì)胞活力下降，半抑制濃度IC50分別約為0.1和0.3 μmol·L-1；其中，當(dāng)MG132濃度在0.2～1.6 μmol·L-1期間TCA8113細(xì)胞活力曲線處在平緩階段，說(shuō)明這期間MG132對(duì)TCA8113細(xì)胞毒性作用變化不大。RA190對(duì)CAL27、TCA8113細(xì)胞的IC50分別約為0.18和1.6 μmol·L-1；RA190濃度在0.2～0.8 μmol·L-1期間CAL27細(xì)胞活力曲線平緩，在0.8 μmol·L-1之后活力曲線處于平臺(tái)階段，說(shuō)明部分CAL27細(xì)胞對(duì)RA190耐藥；RA190濃度為0.8 μmol·L-1左右TCA8113細(xì)胞活力才開始下降，說(shuō)明RA190需要在較大的濃度下才對(duì)TCA8113細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

Fig 3 Cell viability of CAL27 and TCA8113 cells treated with different RA190 or MG132 concentrations for 24 h

2.2 RA190、MG132對(duì)舌癌細(xì)胞周期作用細(xì)胞以5×108·L-1接種6孔板2 mL，設(shè)0.5、1 μmol·L-1RA190或MG132實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各組2個(gè)復(fù)孔，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期變化，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。如Fig 4、Tab 1所示，0.5、1 μmol·L-1RA190(R0.5， R1)均誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞G1/G0期停滯，對(duì)TCA8113周期無(wú)影響；1 μmol·L-1RA190也誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞G2/M期停滯；0.5、1 μmol·L-1MG132(M0.5，M1)均誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞G2/M期停滯，對(duì)TCA8113周期無(wú)影響。

Fig 4 Cycle of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

2.3 RA190、MG132對(duì)舌癌細(xì)胞凋亡影響細(xì)胞以5×108·L-1接種6孔板2 mL，設(shè)0.5、1 μmol·L-1RA190或MG132實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各組2個(gè)復(fù)孔，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。如Fig 5、Tab 2所示，在0.3、0.5、1 μmol·L-1MG132作用下，CAL27與TCA8113細(xì)胞早期與晚期凋亡率均提高(P<0.05)，并與劑量呈線性關(guān)系；0.5、1 μmol·L-1RA190均對(duì)CAL27凋亡無(wú)影響，1 μmol·L-1RA190提高TCA8113細(xì)胞早期與晚期凋亡率[(4±1)%，(5.97±0.86)%；P<0.05)]。

Fig 5 Apoptosis of TCA8113 cells treated with 1 μmol·L-1 RA190 or MG132 for 24 n=3)

2.4 RA190、MG132對(duì)舌癌細(xì)胞內(nèi)ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak蛋白表達(dá)的影響為探討RA190與MG132對(duì)舌癌細(xì)胞的毒性作用與ADRM1的相關(guān)性及兩藥作用機(jī)制差異性，本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè) 0.5、1 、2 μmol·L-1RA190或MG132(R0.5，R1，R2；M0.5，M1，M2)作用24 h后，舌癌細(xì)胞內(nèi)ADRM1、Cyclin B1、Bax、Bak蛋白表達(dá)變化。如Fig 6所示，TCA8113細(xì)胞內(nèi)ADRM1蛋白水平顯著低于CAL27細(xì)胞(P<0.05)；隨著RA190或MG132藥物濃度提高，Cyclin B1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，ADRM1、Bax、Bak蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；TCA8113細(xì)胞在1 μmol·L-1RA190作用下ADRM1、Bak、Cyclin B1蛋白表達(dá)差異不大，而在相同濃度MG132作用下，Bax表達(dá)下調(diào)、Cyclin B1表達(dá)上調(diào)。

Tab 1 Cycle of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

Tab 2 Apoptosis of CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

Fig 6 Expression of ADRM1, Cyclin B1, Bax and Bak protein in CAL27 and TCA8113 cells treated with different concentrations of RA190 or MG132 for 24 h n=3)

3 討論

實(shí)驗(yàn)中，本課題組發(fā)現(xiàn)，TCA8113細(xì)胞種板24 h后，有大量懸浮細(xì)胞，這些細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色觀察，活率達(dá)75%；吸取懸浮細(xì)胞種板，大量細(xì)胞仍可貼壁。因此，藥物對(duì)舌癌細(xì)胞的毒性觀察應(yīng)包含這部分懸浮細(xì)胞。綜合Fig3～5結(jié)果：①RA190組：RA190引起CAL27細(xì)胞活力下降，對(duì)CAL27細(xì)胞凋亡無(wú)作用，提示RA190可能主要通過(guò)阻滯CAL27細(xì)胞于G0/G1或G2/M期引起細(xì)胞活力下降；相反，RA190對(duì)TCA8113周期無(wú)顯著影響，但在0.8 μmol·L-1之后通過(guò)促凋亡作用對(duì)TCA8113細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用；RA190作用下舌癌細(xì)胞活力曲線中間部分較為平緩，可能是貼壁細(xì)胞對(duì)RA190較不敏感。這提示RA190在舌癌中作用具有很大的選擇性和局限性。② MG132組： MG132誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞G2/M期停滯，對(duì)TCA8113細(xì)胞無(wú)影響；MG132明顯提高CAL27與TCA8113細(xì)胞早期與晚期凋亡率，說(shuō)明MG132主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡引起舌癌細(xì)胞活力下降；MG132可影響CAL27周期和凋亡，這導(dǎo)致MG132對(duì)CAL27細(xì)胞毒性作用強(qiáng)于TCA8113細(xì)胞。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Cyclin B從G1期晚期開始表達(dá)并逐漸積累，到G2期后期階段達(dá)到最大值并一直維持到M期的中期階段，然后迅速降解。CAL27細(xì)胞在RA190或MG132作用下G2期阻滯，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)Cyclin B1蛋白表達(dá)上調(diào)，兩者結(jié)果一致。

Bak、Bax是人體重要促凋亡分子，下調(diào)Bax、Bak蛋白表達(dá)，可能抑制細(xì)胞凋亡，從而提高細(xì)胞存活率。但本實(shí)驗(yàn)中MG132明顯促進(jìn)CAL27細(xì)胞凋亡，此時(shí)Bax、Bak蛋白表達(dá)減少，兩者存在矛盾。這可能是MG132促CAL27細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)；也可能提示MG132對(duì)CAL27細(xì)胞促凋亡作用存在其他機(jī)制，具體有待進(jìn)一步研究。這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供新思考。

MG132與RA190明顯下調(diào)CAL27內(nèi)ADRM1蛋白表達(dá)，但RA190對(duì)該細(xì)胞凋亡無(wú)明顯作用，提示ADRM1不是影響舌癌發(fā)生發(fā)展的癌基因。同時(shí)，RA190下調(diào)CAL27內(nèi)ADRM1蛋白表達(dá)，與其濃度呈線性關(guān)系，而MG132則不存在這種線性關(guān)系，這說(shuō)明ADRM1介導(dǎo)的蛋白酶體泛素化路徑不是MG132在舌癌細(xì)胞中的主要作用途徑；MG132在舌癌中存在其他重要作用通路，具體有待進(jìn)一步研究。另外，MG132明顯促進(jìn)CAL27細(xì)胞凋亡，具有明顯毒性作用，可能用于舌癌治療，但由于其作用靶點(diǎn)不單一，因此可能存在較多的副作用。

綜上，本研究認(rèn)為靶向ADRM1藥物RA190僅適用于ADRM1高表達(dá)舌癌治療，但其IC50濃度相對(duì)MG132較高，用于舌癌治療可能并不理想；本研究同時(shí)也為舌癌臨床采用蛋白酶體抑制劑策略奠定基礎(chǔ)。