于 蕾，賀曉麗

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種在老年人中發(fā)病率極高的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是繼癌癥、心血管疾病及腦卒中后致人類死亡的第四大病因。其癥狀往往隨著年齡的增長而惡化，從輕度記憶障礙逐漸發(fā)展為嚴(yán)重的癡呆，包括語言技能的喪失、認(rèn)知缺陷、視覺空間功能障礙、執(zhí)行功能喪失等。AD發(fā)生具有隱匿性，按照病情發(fā)展可以被分為：無癥狀臨床前期、輕度認(rèn)知功能障礙期(mild cognitive impairment，MCI)和癡呆期。MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)最早由美國精神科專家Petersen在1999年提出，其是指處于正常老化和癡呆的一種中間過渡狀態(tài)[1]。MCI具有轉(zhuǎn)化為AD的高度危險性，年轉(zhuǎn)化率為10%～15%，AD患者中有2/3由MCI轉(zhuǎn)化而來，是正常老年人的10倍[2-3]。目前，國際上還沒有特效AD治療藥物，如果能在MCI階段進行早期發(fā)現(xiàn)和有效干預(yù)，將可能會大大降低AD的發(fā)病率。

隨著對AD研究的深入，MCI逐漸成為基礎(chǔ)研究者的關(guān)注焦點。為了進行AD發(fā)病機制研究、藥物篩選以及新藥研發(fā)等，成功建立具有MCI特征的動物模型是必須的。但目前建立的MCI研究模型如何有效區(qū)別于AD模型仍存在著一定困難。故本綜述從AD和MCI的病理特征和診斷標(biāo)準(zhǔn)入手，通過介紹常用AD和MCI實驗動物模型的研究進展，從模型建立的角度對其進行總結(jié)和初步評價，為開展AD和MCI的研究提供建議。

1 AD與MCI的特征

關(guān)于AD的發(fā)病機制目前尚無定論，存在的假說有β-淀粉樣蛋白異常沉積、膽堿能損傷學(xué)說、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激、炎癥以及胰島素信號傳導(dǎo)通路障礙等，比較公認(rèn)的是β-淀粉樣蛋白異常沉積、Tau蛋白過度磷酸化和膽堿能損傷學(xué)說[4]。研究表明[1]，MCI患者的Meynert基底核區(qū)膽堿能神經(jīng)元無減少，而早期AD患者減少15%。此外，MRI結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCI患者的海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)的體積減少處于AD和正常老化之間，并且減少的速度高于正常老化人群[5]，MCI病人的海馬結(jié)構(gòu)越小，AD轉(zhuǎn)化率越高[1]，因此通過MRI定量測量海馬萎縮，可預(yù)測MCI轉(zhuǎn)化為AD的危險性。通過VBM分析證實[6]，AD患者的灰質(zhì)在海馬、海馬旁回、顳極、尾狀核頭、丘腦內(nèi)側(cè)、腦島和杏仁核等部位發(fā)生退化，且左腦灰質(zhì)體積萎縮更為顯著，而MCI患者始于顳葉與額葉的灰質(zhì)萎縮，導(dǎo)致聽覺與記憶功能退化。

MCI作為AD的極早期階段，介于正常衰老與老年癡呆的過渡狀態(tài)，尚未達到癡呆程度，尸檢同樣發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的AD和MCI患者的病理特征相似[7]，但是只在程度上有所區(qū)別。AD患者腦部萎縮更為嚴(yán)重，病變部位更多，主要表現(xiàn)為乙酰膽堿活性不足；AD患者認(rèn)知功能為多領(lǐng)域受損，而MCI的認(rèn)知功能損害可能只局限于一個或者幾個認(rèn)知領(lǐng)域。結(jié)合MCI的病理表現(xiàn)，MCI動物模型的理想特征應(yīng)為老年、輕微的記憶受損、輕度神經(jīng)病理改變、膽堿能系統(tǒng)改變、以及腦血管改變等，至少出現(xiàn)上述兩種特征，即可以被合理地認(rèn)為是MCI模型[8]。AD和MCI實驗動物模型之間的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括模型動物發(fā)生認(rèn)知障礙的年齡，以及認(rèn)知損害的嚴(yán)重程度[3]。

2 動物模型及造模方法

AD和MCI動物模型按產(chǎn)生原因大致分為兩類：一是先天性動物模型，即動物本身所帶有的相關(guān)病變，如代謝紊亂或特定蛋白質(zhì)合成障礙等，常用的有轉(zhuǎn)基因模型、基因敲除模型和快速老化小鼠等；二是后發(fā)性動物模型，人為介入物理、化學(xué)、生物等致病因素，誘發(fā)模型呈現(xiàn)部分或全部疾病特征，如膽堿能損傷模型、D-半乳糖模型、鋁中毒模型和Aβ側(cè)腦室注射模型等，本綜述主要討論后者。

2.1 常用AD動物模型

2.1.1膽堿能損傷模型 膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)是參與學(xué)習(xí)和記憶最重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)起著關(guān)鍵性作用，能特異性的作用于各類膽堿能受體。膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化作用下合成ACh，進入突觸間隙的ACh作用于突觸后膜發(fā)揮生理作用后被AChE水解成膽堿和乙酸，從而終止膽堿能神經(jīng)的信號傳遞，整個過程中AChE和ChAT共同維持ACh的含量和膽堿能系統(tǒng)的動態(tài)平衡。AD患者腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)發(fā)生紊亂，ACh含量減少，是導(dǎo)致記憶力下降的主要原因。因此破壞動物腦內(nèi)的膽堿能系統(tǒng)，可以重現(xiàn)AD膽堿能衰退的病理特征來制作AD動物模型。但該模型不出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)等AD的典型病理改變，因此多應(yīng)用于膽堿能系統(tǒng)的機制研究及藥物評價。

2.1.1.1 東莨菪堿誘導(dǎo)膽堿能損傷模型 東莨菪堿是M型乙酰膽堿受體競爭性阻斷藥，能夠誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膽堿能神經(jīng)通路及記憶環(huán)路的功能紊亂，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶的嚴(yán)重?fù)p傷。由于東莨菪堿與突觸后膜M型乙酰膽堿受體的結(jié)合是可逆的，故其阻斷學(xué)習(xí)記憶的作用具有一過性特征。該模型通常采用KM、ICR或C57BL/6J小鼠，于行為學(xué)實驗前15 min或30 min腹腔注射東莨菪堿1～3 mg·kg-1[9-10]。少量文獻使用5 mg·kg-1劑量或0.2 mg·kg-1連續(xù)6 d。后進行跳臺、避暗、穿梭箱等實驗進行學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測，并進行病理學(xué)檢查，以評價模型是否成功。

2.1.1.2 基底前腦膽堿能神經(jīng)元選擇性損傷模型 興奮性氨基酸主要存在于神經(jīng)元的突觸末端及各種神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞體和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，過量的興奮性氨基酸可能對神經(jīng)細(xì)胞造成毒性作用。鵝膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBO)是一種含有異噁唑環(huán)的興奮性氨基酸，具有較強的神經(jīng)毒性，其與神經(jīng)細(xì)胞樹突上的N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受體相結(jié)合而作用于Ca2+通道，使大量Ca2+內(nèi)流，造成膽堿能神經(jīng)元損傷和功能喪失，引起學(xué)習(xí)記憶能力減退，乙酰膽堿含量降低以模擬AD。該模型采用SD雄性大鼠手術(shù)造模，腦部雙側(cè)注射鵝膏蕈氨酸，每側(cè)注射時間5 min，留針5 min，緩慢起針縫合切口并肌注適量慶大霉素。對照組(假手術(shù)組)注射等量PBS或生理鹽水。造模14 d后，通過行為學(xué)實驗及病理學(xué)檢查以確定模型是否成功[11-12]。

2.1.2Aβ?lián)p傷模型 AD的病理特征主要為腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)元丟失及神經(jīng)纖維纏結(jié)形成。正常生理情況下人體中的β-淀粉樣前體蛋白降解均會產(chǎn)生少量的Aβ40和Aβ42，其以可溶性、低濃度形式存在于腦脊液和血漿中，并不會產(chǎn)生神經(jīng)毒性。病理狀態(tài)下，Aβ42含量升高且Aβ42更易聚集形成淀粉樣蛋白，是形成老年斑的主要成分，提示它在AD發(fā)病機制中占有更重要的作用。Aβ誘導(dǎo)的AD動物模型，一般采用雄性ICR小鼠或雄性Wistar大鼠，將人工合成的Aβ在微滲透泵的推動下注射入動物的側(cè)腦室或海馬組織中，模擬Aβ對中樞神經(jīng)的毒性[13-14]。

2.1.3岡田酸(OA)致Tau蛋白損傷模型 Tau蛋白屬于微管相關(guān)蛋白(MAPs)家族，于1975年被發(fā)現(xiàn)且被鑒定為細(xì)胞骨架中裝配和穩(wěn)定微管的必需成分,主要存在于細(xì)胞軸突。Tau蛋白的錯誤折疊和病理改變是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的基礎(chǔ)，高度磷酸化的Tau蛋白因為結(jié)構(gòu)的改變可以形成寡聚體，寡聚體進一步形成具有雙螺旋紐帶結(jié)構(gòu)的成對螺旋絲(PHFs)。PHFs進一步形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而導(dǎo)致突觸消失，認(rèn)知能力下降。岡田酸是一種磷酸酯酶抑制劑，可以快速的代謝進而改變體內(nèi)磷酸化-去磷酸化速率。通常采用Wistar雄性大鼠，向其側(cè)腦室微泵注入磷酸酯酶抑制劑，使磷酸化的Tau蛋白呈現(xiàn)雙螺旋細(xì)絲狀的病理改變，從而導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白沉積和隨后的神經(jīng)元變性、突觸損失和記憶障礙[15]。

2.1.4D-半乳糖(D-gal)模型 D-gal是人體中的一種還原性糖，可以在正常生理濃度下代謝為葡萄糖。但是在高濃度下，D-gal在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，半乳糖醇繼而被激活后的半乳糖脫氫酶氧化，生成氧化產(chǎn)物過氧化氫和醛，這一過程共產(chǎn)生3種活性氧自由基(ROS)，過量的ROS進一步攻擊細(xì)胞，引起神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，從而動物出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙和機體衰老等特征。文獻報道[16]通過檢索1996～2007年CNKI和NCBI文獻，D-Gal致衰老模型鼠主要有KM、ICR或BALB/C小鼠，其中KM小鼠所占比例為0.797。D-Gal造模方法主要為頸背部皮下注射或腹腔注射，而頸背部皮下注射占比約為0.824。D-Gal常用濃度為50～500 mg·kg-1不等，其中100～150 mg·kg-1所占比例為0.488。我們通過NCBI篩查近5年英文文獻，發(fā)現(xiàn)模型鼠以昆明鼠、ICR、BALB/C居多，D-gal劑量在100～150 mg·kg-1造模時間為8～10周，而D-gal劑量在500 mg·kg-1造模時間為5～6周，給藥方式均為生理鹽水溶解后頸背部皮下注射[17-18]。

2.1.5鋁中毒模型 鋁是自然界分布極其廣泛的一種金屬，一般以化合態(tài)存在，有研究表明高水平的鋁會增加某些神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險，包括透析性腦病、AD和帕金森病(PD)等。動物實驗表明鋁會導(dǎo)致神經(jīng)病理、神經(jīng)行為、神經(jīng)化學(xué)的改變從而導(dǎo)致記憶能力損傷。鋁中毒模型一般采用連續(xù)或間隔灌胃AlCl3溶液10～500 mg·kg-16～12周，大鼠通常使用Wistar大鼠，小鼠可使用KM或者ICR小鼠[19-20]。

2.2 常用MCI動物模型AD在臨床上治療效果不佳的主要原因之一是干預(yù)時機太晚，在診斷出癡呆時記憶已經(jīng)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)性損害，同時伴隨有大量神經(jīng)元凋亡。因此一些學(xué)者提出，應(yīng)當(dāng)把干預(yù)時間前移，即在MCI階段介入治療。對MCI的干預(yù)目的是為了預(yù)防、延緩甚至是扭轉(zhuǎn)其向AD轉(zhuǎn)化的進程。針對這一目的的干預(yù)措施分為：臨床手段和非臨床手段。而由于提出MCI這個概念時間尚短和其本身的不確定性，非臨床研究開展的較少。

以輕度認(rèn)知障礙為主題詞合并關(guān)鍵詞動物在CNKI檢索，共有69條結(jié)果，有效文章5篇。以Mild cognitive impairment為主題詞合并Animal在NCBI檢索，共有72條結(jié)果，有效文章1篇。再以輕度認(rèn)知障礙和Mild cognitive impairment分別在CNKI和NCBI對檢索結(jié)果進行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)動物輕度認(rèn)知障礙模型主要包括姚明江等[21]以大鼠頸背部皮下連續(xù)5～10周注射D-半乳糖50 mg·kg-1，后高脂飼料喂養(yǎng)2～5周構(gòu)建的老年輕度認(rèn)知障礙模型。徐世軍等[22]使用KM小鼠，行為學(xué)實驗前30 min前腹腔注射東莨菪堿2 mg·kg-1造模。

在基礎(chǔ)研究方面，AD實驗動物模型有多種類型，MCI研究模型應(yīng)區(qū)別于AD模型。原則上AD的動物模型在早期時，可以模擬輕度認(rèn)知障礙，如已經(jīng)報道的先天性動物模型，包括轉(zhuǎn)基因鼠和老化鼠等[3,23]。但是本文主要討論后發(fā)性動物模型，即上述由人為介入物理、化學(xué)、生物等致病因素而造成的模型。而以上實驗中報道的MCI模型無論是在造模周期、給藥劑量、還是給藥方式上與AD模型都沒有顯著的差異，同時在實驗中也沒有明確給出判斷為MCI的指標(biāo)或標(biāo)準(zhǔn)。毋庸置疑的是在上述模型中一定存在MCI階段，但是在現(xiàn)階段還無法準(zhǔn)確判斷其發(fā)生的具體時間。

3 評價

通過模型總結(jié)發(fā)現(xiàn)：膽堿能神經(jīng)元選擇性損傷誘導(dǎo)的癡呆模型可以模擬人大腦皮層、海馬等腦區(qū)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損害和記憶認(rèn)知行為的改變，造模時間短，價格便宜，但該模型存在一定的弊端：東莨菪堿引起的膽堿能功能損害是可逆的，具有一過性特征；IBO所誘導(dǎo)的癡呆僅模擬了與認(rèn)知功能有關(guān)的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損害相關(guān)的信息，并有可能損害鄰近注射部位的非膽堿能神經(jīng)元。Aβ/岡田酸注射模型模擬了癡呆的認(rèn)知功能障礙和某些病理改變，具有操作簡單、時程短、成本低等優(yōu)點，適用于抗癡呆藥物篩選研究。但應(yīng)注意在腦部導(dǎo)入Aβ/岡田酸的同時動物都有一定的局灶型損傷，且大量Aβ或?qū)锼釓浬⒎植嫉侥X是該模型所需要解決的問題，并且動物體內(nèi)存在Aβ清除機制，因此模型很難達到滿意的效果。另外，腦內(nèi)注射Aβ/岡田酸是一種急性單因素模型，不符合AD慢性起病的特點。D-gal致衰老模型在造模過程中表現(xiàn)出接近自然老化的生理特點，出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶能力減退、海馬錐體細(xì)胞減少、病理細(xì)胞增多等現(xiàn)象。又因為其價格低、操作方便、重復(fù)性高等特點，廣泛用于AD和MCI的D-gal致衰老模型，同時也可以與其他造模方式聯(lián)合起來制作需要的模型。但其對氧化機制的闡釋與AD經(jīng)典病理特征的呈現(xiàn)仍有不足。鋁損傷模型模擬了AD膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能下降及記憶力減退的特征，但此模型形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)中Tau蛋白沒有磷酸化成PHF，中樞膽堿能活性正常，而且造模周期較長。

現(xiàn)今已經(jīng)有很多實驗室采用復(fù)合方法造模。羅煥敏等[24]采用D-gal合并AlCl3成功制備符合發(fā)病特征的AD模型；曾芳等[25]在腹腔注射D-gal的基礎(chǔ)上，采用側(cè)腦室注射Aβ，該模型體現(xiàn)了Aβ沉積和記憶功能損害等AD主要的病理學(xué)特征。采用復(fù)合多因素模型，更符合癡呆病癥的多靶點特征，有可能在抗癡呆領(lǐng)域得到更為廣泛的應(yīng)用。

對于AD或者MCI，臨床診斷方法包括生物標(biāo)志物檢測、神經(jīng)心理學(xué)評估量表、基因檢測、影像學(xué)檢查等，并分別制定了詳細(xì)的診斷和治療指南。在基礎(chǔ)研究方面，由于動物實驗的局限性以及可行性問題，即使每年發(fā)表大量AD的研究文章，但是缺少明確的評價指標(biāo)來判斷究竟模型是AD模型還是MCI模型。所以在已發(fā)表文章中針對基礎(chǔ)研究的MCI階段，存在兩個疑慮，其一：MCI模型是否造模成功；其二：如何認(rèn)定所建立的模型是AD還是MCI模型。

4 結(jié)語

AD由于其疾病本身的復(fù)雜性，單一造模存在很大弊端，越來越多的研究趨向于復(fù)合造模，目前為止，尚無對復(fù)合造模效果的比較研究，由于AD和MCI的發(fā)病機制不夠明確，且猜想靶點和致病因素較多，世界范圍內(nèi)目前未發(fā)現(xiàn)能夠全面再現(xiàn)人AD、MCI病理特征的動物模型。但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，采用復(fù)合方法造模能在很大程度上表現(xiàn)出更為接近AD或MCI特征的模型動物，為癡呆的研究提出了更深入的探索方向。迄今為止沒有公認(rèn)的AD或MCI動物模型，研究者只能從藥物和疾病本身的特征出發(fā)，選擇匹配度較高的模型用于研究。一般而言，基礎(chǔ)研究的藥效評價多數(shù)依賴于動物指標(biāo)，所以模型的選擇、模型成功與否、能否精準(zhǔn)造模以符合疾病特征等是實驗過程中我們需要慎重考慮的問題。

致謝：本綜述在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所完成，指導(dǎo)老師賀曉麗老師。