萬 星，李相國，李修賢，呂慧芬，黃德斌，胡澤華

(湖北民族大學(xué) 1. 醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)教研室，2. 科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，3. 醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室, 湖北 恩施 445000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指各種慢性肝病引起的細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟過度沉積，其病理特征為肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生[1]，及時有效的抗纖維化治療是防止慢性肝病向終末期肝病轉(zhuǎn)化的必要措施。Beta-谷甾醇(Beta-sitosterol，BS)是一種常見的植物甾醇，廣泛存在于植物葉子、植物油和果蔬中，具有良好的抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理活性[2]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健品領(lǐng)域。炎癥是病毒、藥物、酒精等病因引起慢性肝病發(fā)展的一個動態(tài)和共同過程，慢性炎癥進(jìn)一步發(fā)展最終引起肝纖維化甚至肝癌。Gupta等[3]和Valerio等[4]報道，Beta-谷甾醇具有類似氫化可的松的抗炎作用，能提高IL-10的活性，抑制NF-κB的遷移。以炎癥為切入點(diǎn)，本文將初次探討B(tài)eta-谷甾醇對四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物C57BL/6小鼠，♂，體質(zhì)量(17±3)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK京2016-0011。

1.2 藥品與試劑BS(LOT:R08S7F20751，純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)；CCL4(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，臨用前溶于橄欖油)；ALT、AST試劑盒(AST,ALT:LOT:20171017，南京建成生物工程研究所)；TNF-α試劑盒(美國BD公司)；鼠源α-SMA(LOT:GR239100-1) 、 collagenⅠ、TβR1(LOT:GR201638-3)、Smad2/3(LOT:GR221934-8) 、NF-κB 和 p-NF-κB一抗(英國Abcam公司)；β-actin一抗、山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)

1.3 儀器顯微鏡(Nikon E200，日本)；電子天平(YP5002,上海越平)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan GO，美國)；石蠟切片機(jī)(Thermo Fisher HM325，美國)；蛋白電泳儀(Bio-Rad, 美國)；蛋白濕轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad, 美國)。

2 方法

2.1 BS配制每只動物灌胃體積在0.1～0.4 mL適宜。取一瓶BS 20 mg研磨成細(xì)粉加橄欖油，在溫水浴中加速溶解，定容到41.7 mL，配成高劑量0.48 g·L-1的溶液，然后從中取20 mL溶液加橄欖油，定容到30 mL，配成中劑量0.32 g·L-1的溶液，再從該溶液中取10 mL加橄欖油，定容到20 mL，配成低劑量0.16 g·L-1的溶液，每管溶液約為10只小鼠1周的用量。

2.2 動物分組、給藥[5-6]與造模50只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為5組：正常組(control group，CG)、CCL4模型組(carbon tetrachloride group，CTG)、2 mg·kg-1Beta-谷甾醇組(BS-L)、4 mg·kg-1Beta-谷甾醇組(BS-M)、6 mg·kg-1Beta-谷甾醇組(BS-H)。模型組小鼠腹腔注射含25% CCL4的橄欖油溶液1.6 mL·kg-1，每周2次，30 d共9次。藥物組在造模同時，d 1～15灌胃BS，每次灌0.25 mL，正常組灌胃等體積生理鹽水。所有小鼠30 d后禁食不禁水，24 h后處死，按要求做后續(xù)操作。

2.3 肝臟外觀形態(tài)觀察及肝指數(shù)測定小鼠稱重，眼球采血，頸椎脫臼處死后，取肝臟，用高倍相機(jī)在同背景同視野下拍外觀形態(tài)。生理鹽水洗血，濾紙吸干，稱量肝重。肝指數(shù)=肝臟重量(g)/體質(zhì)量(g)×100%

2.4 血清學(xué)指標(biāo)檢測小鼠采血后，靜置分離得血清，按照kit要求測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotrans，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的含量。

2.5 HE染色肝臟用10%甲醛固定24 h，HE染色，石蠟切片在二甲苯脫臘3次，過梯度乙醇各5 min，水洗1 min，蘇木精染色5 min，水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，伊紅染2 s，乙醇脫水2 min，二甲苯透明、封固、鏡檢。

2.6 Masson染色常規(guī)脫水包埋，切片脫臘至水，Harris蘇木精染色10 min，流水稍洗，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，麗春紅酸性品紅染液染5 min，流水稍洗，磷鉬酸溶液5 min，苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，95%乙醇多次脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.7 免疫組織化學(xué)檢測α-SMA、CollagenⅠ含量石蠟切片脫蠟至水，高溫高壓修復(fù)2 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)入TBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶室溫20 min，TBS沖洗3次，每次5 min，10%山羊血清孵育20 min，一抗(α-SMA：1 ∶150，CollageⅠ：1 ∶600)4 ℃過夜，次日復(fù)溫后，TBS沖洗3次，每次5 min，每張切片滴50 μL二抗，室溫孵育30 min，TBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化2 s，溫水返藍(lán)，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，封片。

2.8 Western blot檢測α-SMA、CollageⅠ、TβR1、Smad2/3 、NF-κB 和 p-NF-κB蛋白表達(dá)稱肝臟組織100 mg，加1 mL Ripa裂解液勻漿破組織，再超聲破碎(超聲時間3 s，間隔10 s，超聲10次)，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1,4 ℃，離心20 min，取上清，BCA法測蛋白濃度后，加5×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，-20 ℃保存。配10%的分離膠，電泳條件：60 V，30 min濃縮，110 V，70 min分離，電轉(zhuǎn)條件：110 V恒壓，75 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗：α-SMA：1 ∶3 000、collagenⅠ：1 ∶3 000、TβR1:1 ∶100、Smad2/3:1 ∶500、 NF-κB/p-NF-κB:1 ∶1 000，4 ℃過夜，TBST洗脫，孵二抗：1 ∶80 000，90 min，TBST洗脫，曝光。

3 結(jié)果

3.1 BS對CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化肝臟大體形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)的影響大體觀察肝臟表面顏色和光滑度，HE染色觀察肝內(nèi)結(jié)構(gòu)，炎癥水腫等，Masson染色觀察膠原生成情況。正常組肝臟包膜光滑，呈紅褐色，小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無膠原沉積；CCL4組肝臟表面彌漫明顯大小不一的塌陷區(qū)，邊緣泛白，肝小葉被破壞，肝不同程度的水腫、結(jié)構(gòu)紊亂、明顯腫脹變形，有點(diǎn)狀、片狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤，肝索紊亂，大量膠原沉積分離原來的肝小葉形成假小葉；BS各組量效依賴地減少肝臟表面塌陷數(shù)量，肝索較整齊，炎性細(xì)胞減少，水腫改變不明顯，膠原沉積仍可見，但少于CCL4組。見Fig 1。

3.2 BS對CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化肝指數(shù)的影響肝指數(shù)一定程度上反映肝臟腫脹。CTG組肝指數(shù)高于CG組(P<0.05),BS較CTG組，量效依賴地降低肝指數(shù)(P<0.05)。見Fig 2。

3.3 BS對CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化血清ALT、AST的影響與CG組比，CTG組ALT、AST活性明顯升高(P<0.01)，BS組量效依賴地降低其表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，其中，對ALT的降低效果更好。見Fig 3。

3.4 BS對CCL4誘導(dǎo)小鼠肝組織α-SMA、CollagenⅠ的影響肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化的關(guān)鍵步驟。α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志[7]，而CollagenⅠ是肝星狀細(xì)胞活化后釋放的最主要的細(xì)胞外基質(zhì)[8]。利用Western blot和免疫組織化學(xué)進(jìn)行BS對α-SMA、CollagenⅠ的探究。鏡下可見：與正常組比，CCL4組α-SMA、CollagenⅠ表達(dá)明顯增加，BS量效依賴地降低了α-SMA、CollagenⅠ表達(dá)，見Fig 4； Western blot的結(jié)果提示，CCL4明顯增加了α-SMA、CollagenⅠ蛋白含量(P<0.01)，較正常組，不同劑量的BS降低了CCL4誘導(dǎo)地α-SMA、CollagenⅠ的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性。見Fig 5。

Fig 1 Effect of different doses of BS on liver morphology by eye, HE and Masson staining

Fig 2 Effect of different doses of BS on liver

3.5 BS對CCL4誘導(dǎo)地TβR1-Smad2/3信號通路的影響TGF-β是HSCs活化過程和細(xì)胞外基質(zhì)生成過程中的致纖維化因子，通過激活其受體，再激活Smad蛋白，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)信號，是纖維化的一條經(jīng)典通路。CCL4誘導(dǎo)肝纖維化時，TGF-β受體(TβR1)和Smad2/3發(fā)生顯著性高表達(dá)(P<0.01)，中劑量的BS降低了TβR1、Smad2/3的表達(dá)(P<0.01)。見Fig 6。

Fig 3 Effect of different doses of BS on activities

3.6 BS對CCL4誘導(dǎo)地TNF-α- NF-κB信號通路的影響炎癥因子，如TNF-α，是CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化的參與者[9]，且增加炎癥因子數(shù)量的NF-κB也會被CCL4激活[10]。較正常組、CTG組TNF-α顯著性增高，BS-M降低其表達(dá)(P<0.01)。見Fig 7；如Fig 8，較正常組，p-NF-κB、NF-κB在CTG組表達(dá)增高，BS-M亦降低其表達(dá)(P<0.01)。見Fig 8。

Fig 4 Effect of different doses of BS on α-SMA and Collagen I by IHC(×100)

Fig 5 Effect of different doses of BS on α-SMA and

Fig 6 Effect of BS-M on TβR1 and Smad2/3

Fig 7 Effect of BS-M on TNF-α by n=10)

Fig 8 Effect of BS-M on NF-κB by Western n=6)

4 討論

甾醇分動物甾醇、植物甾醇和菌類甾醇，BS是四環(huán)三萜類，是植物甾醇最常見的類型之一，占總甾醇的50%～65%[11]，是一種重要的天然甾體，被譽(yù)為“生命的鑰匙”[12]，BS最初研究都集中在降膽固醇功效及機(jī)制上，同時降膽固醇功效也是目前研究最多和最深的。后有研究顯示，植物甾醇還有抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用[2]，其分子機(jī)制尚不清楚，也未形成完整的信號通路模型。以抗腫瘤和抗炎作用為結(jié)合點(diǎn)，本文初步探討了其對肝纖維化的作用與作用機(jī)制。

CCL4是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，能活化HSCs，促使肝纖維化。肝纖維化是終末期肝病發(fā)生的基礎(chǔ)，發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，HSCs活化是肝纖維化發(fā)生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，另外，各種細(xì)胞、細(xì)胞因子等也參與此過程[13]。去除致病因素是最佳治療策略，但許多慢性肝病中，致病因素和相關(guān)因素往往難以消除，這表明開發(fā)抑制肝纖維化進(jìn)展并誘導(dǎo)其消退的特異性抗纖維化藥物的重要性。本實(shí)驗(yàn)BS甾醇降低肝指數(shù)，降低血清ALT、AST活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)CollagenⅠ的沉積和HSCs活化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，提示BS能降低肝臟損傷并抑制纖維化進(jìn)程。

TGF-β可以激活HSCs并使其增殖，活化的HSCs可以通過自分泌和旁分泌的途徑持續(xù)不斷的釋放細(xì)胞外基質(zhì)，激活鄰近的HSCs，導(dǎo)致持續(xù)不斷地發(fā)生纖維化。TGFβ/Smad信號通路是肝纖維化過程討論得最為廣泛的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)中，CCL4組明顯升高了TGFβ和Smad2/3的蛋白含量，BS降低其表達(dá)，提示BS干預(yù)了此條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕纖維化程度。

NF-κB信號通路能加快HSCs的激活，其抑制劑能降低肝纖維一些重要蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)HSCs產(chǎn)生凋亡，延緩纖維化進(jìn)程[14]，也有學(xué)者報道，在膽總管結(jié)扎的肝纖維化中，TNF-α也加重纖維化程度[15]。同時，本課題前期工作也驗(yàn)證TNF-α參與肝纖維，本實(shí)驗(yàn)中，選擇TNF-α-NF-κB這條經(jīng)典的炎癥通路做了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL4組，TNF-α和p- NF-κB高表達(dá)，BS明顯地降低了其表達(dá)，提示BS亦干預(yù)了此條炎癥通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，BS對CCL4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與TGFβ/Smad2/3和TNF-α- NF-κB相關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝支持。)