李中杰 吳曉敏 潘曉華*

1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000 2.廣東醫(yī)科大學(xué)深圳寶安臨床醫(yī)學(xué)院/南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院，廣東 深圳 518100

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，是人類主要的致殘?jiān)蛑?，影響了全?5%以上的人口[1]。最新的流行病學(xué)研究表明，中國(guó)目前有癥狀的膝骨關(guān)節(jié)炎患者高達(dá)1.1億，這將造成重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。在發(fā)病機(jī)制上，雖然目前的研究表明其與細(xì)胞因子、信號(hào)通路、基質(zhì)金屬蛋白酶及免疫因素等有關(guān)[3]，但具體的作用機(jī)制仍未十分明確；在診斷上，目前OA診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]不適用于早期診斷，有研究[5]發(fā)現(xiàn)，在OA早期能觀察到關(guān)節(jié)軟骨明顯的修復(fù)反應(yīng)，而在中晚期修復(fù)效果并不理想，因此早期診斷并及時(shí)治療是關(guān)鍵所在。已知miR-140與軟骨細(xì)胞分化有關(guān)，有研究[6]表明miR-140-3p在膝關(guān)節(jié)滑液中有表達(dá)，并且與OA的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，提示miR-140-3p有可能成為膝關(guān)節(jié)OA早期診斷的候選標(biāo)志物；在治療上，關(guān)節(jié)腔注射皮質(zhì)類固醇或透明質(zhì)酸對(duì)早期OA具有一定療效但又存在爭(zhēng)議[7]，晚期OA雖然能通過關(guān)節(jié)置換手術(shù)解決，但植入物壽命等問題一直是業(yè)界的難題?；谀壳皩?duì)OA發(fā)病機(jī)制的局限性認(rèn)知及突破的需要，外泌體作為一種細(xì)胞間的通訊介質(zhì)因可以保護(hù)其內(nèi)容物直接遞送至相關(guān)細(xì)胞發(fā)揮作用的特性而開始備受矚目[8]。如在OA早期，關(guān)節(jié)腔中的外泌體會(huì)介導(dǎo)抑炎因子和miRNA等協(xié)助軟骨修復(fù)，而中晚期則會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)炎性因子及促炎miRNA的產(chǎn)生加速病理改變。

1 骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的外泌體特點(diǎn)

外泌體(exosomes，exos)是一種直徑為30～120 nm雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡，可遠(yuǎn)距離膜性轉(zhuǎn)運(yùn)供體細(xì)胞內(nèi)的生物小分子(核酸、蛋白等)至受體細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，它幾乎由所有細(xì)胞類型分泌，并廣泛存在于各種生物體液中[9]。研究顯示[10]人類OA關(guān)節(jié)軟骨源的外泌體大小在50～250 nm，并主要富集于鈣化軟骨和軟骨下骨區(qū)域，與堿性磷酸酶活性增加相關(guān)。它們體內(nèi)不僅含有病理性鈣晶體，還含有低表達(dá)的蛋白多糖及各種修飾后的蛋白質(zhì)。用OA滑膜液(synovial fluid，SF)源的外泌體作用于軟骨細(xì)胞后，研究[11]顯示它們?nèi)菀妆卉浌羌?xì)胞內(nèi)吞，提示外泌體在OA中潛在一定特異性。在12例OA和非OA患者滑膜液中,發(fā)現(xiàn)兩組外泌體的大小(OA：0.128 μm、非OA：0.127 μm)和濃度(OA：1.18×1013/L、非OA：1.59×1013/L)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]，但兩組間外泌體的miRNA含量有所不同[12]，進(jìn)一步對(duì)其內(nèi)容物分析發(fā)現(xiàn)miR-200c顯著增加[12]。已知外泌體的內(nèi)容物不受內(nèi)切酶的影響，提示OA外泌體的特異性由其內(nèi)的miRNA等體現(xiàn)的，因此對(duì)外泌體源miRNA更深入的探索將有助于解析其是如何參與或調(diào)控OA的病理生理。

2 外泌體作為OA潛在診療價(jià)值的研究進(jìn)展

2.1 外泌體與OA病理的相關(guān)性

2.1.1軟骨及滑膜：OA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且受多種因素影響[13]。首先，健康關(guān)節(jié)軟骨依賴于軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的維持。軟骨細(xì)胞負(fù)責(zé)合成聚集蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)，后者進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為關(guān)節(jié)軟骨。ECM主要由Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖組成，而后者主要由ACAN組成，ECM的合成和破壞是維持關(guān)節(jié)軟骨的重要基礎(chǔ)。其次，關(guān)節(jié)內(nèi)另外一個(gè)重要的組織是滑膜，滑膜由滑膜巨噬細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞[又稱成纖維滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)]組成，主要負(fù)責(zé)分泌潤(rùn)滑軟骨的關(guān)節(jié)液。這些不同組織或細(xì)胞以外泌體為橋梁從而維持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境平衡或介導(dǎo)OA的發(fā)生發(fā)展[14]。體外研究發(fā)現(xiàn)[15]白介素(IL)-1β所處理的軟骨細(xì)胞源外泌體會(huì)作用于FLS，相較對(duì)照組顯著增加基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13的表達(dá)，同時(shí)滑膜上腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和環(huán)氧化酶-2(COX-2)的數(shù)量也有不同程度的升高，提示外泌體在OA的炎癥過程中起著重要作用。Kato等[16]在FLS與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞之間進(jìn)行外泌體研究，發(fā)現(xiàn)用IL-1β刺激人FLS源外泌體(實(shí)驗(yàn)組)在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)模型中可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞OA樣改變，與FLS源外泌體相比，實(shí)驗(yàn)組可顯著上調(diào)軟骨細(xì)胞MMP-13和血小板反應(yīng)蛋白解聚素金屬蛋白酶5(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs 5，ADAMTS-5)的表達(dá)，并下調(diào)Ⅱ型膠原纖維α1基因(COL2A1)和ACAN的表達(dá)[16]，提示在FLS與軟骨細(xì)胞之間存在著與外泌體相關(guān)的正反饋炎癥通路。此外，實(shí)驗(yàn)組含有大量的MMP-3、IL-6及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，將該外泌體作用于小鼠股骨軟骨移植組織，與對(duì)照組相比其所誘導(dǎo)的ACAN及血管生成數(shù)量更多[16]，通過NanoString分析顯示有50種miRNA表達(dá)水平存在差異[16]，提示血管的生成可能由FLS刺激軟骨基因的表達(dá)產(chǎn)生，因此外泌體內(nèi)miRNA在OA中可能扮演傳遞通路的角色。進(jìn)一步分析miRNA差異表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，IL-1β處理的FLS總共有340種miRNA被上調(diào)，而在FLS源外泌體中僅發(fā)現(xiàn)11種miRNA被上調(diào)，這一研究顯示FLS對(duì)包裝進(jìn)入外泌體的miRNA具有一定的選擇性[16]。值得注意的是，在FLS源外泌體所上調(diào)的11種miRNA中，只有5種在FLS內(nèi)也被上調(diào)[16]，分別是miR-4454、miR-720、miR-199b、miR-500B和miR-3154，其中對(duì)前三者的研究較為深入。miR-4454參與促進(jìn)了軟骨細(xì)胞炎癥[17]，miR-720能促進(jìn)細(xì)胞遷移[18]，miR-199b在軟骨形成過程中增加，而在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)衰老過程中減少[19]。以上研究顯示外泌體中的miRNA不僅在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)節(jié)分子的作用，而且可能影響血管新生進(jìn)而參與OA的發(fā)生發(fā)展。

2.1.2滑液：在OA的病理?xiàng)l件下，滑膜組織會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子、MMP等破壞關(guān)節(jié)軟骨，進(jìn)而加速骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，而滑液在一定程度上又反映滑膜炎癥，因此通過對(duì)滑液內(nèi)容物的研究可能進(jìn)一步揭示骨性關(guān)節(jié)炎的病理。Domenis等[20]發(fā)現(xiàn)用終末期OA患者滑液源外泌體可以促進(jìn)外周血單核細(xì)胞分化的促炎性M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞因子、MMP和趨化因子(CCL)，并認(rèn)為這是關(guān)節(jié)軟骨炎癥及退化的重要因素。Kolhe等[12]也做了類似的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外泌體所處理組顯著降低了關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成代謝基因(COL2A1、ACAN)的表達(dá)，升高了分解代謝和炎癥基因(IL-6、TNF-α)的表達(dá)，這些研究均表明外泌體在OA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。此外，他們還發(fā)現(xiàn)OA患者滑液外泌體miRNA含量的變化具有性別特異性，女性O(shè)A組比男性受到更多miRNA差異調(diào)節(jié)，兩種性別中下調(diào)miRNA顯示與聚糖降解、細(xì)胞粘附分子和黏蛋白型O-聚糖生物合成有關(guān)，上調(diào)miRNA則與甲狀腺激素合成、生物素代謝和苯丙胺成癮信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[12]。其中某些miRNAs，如女性骨關(guān)節(jié)炎患者所下調(diào)miR-26a，是雌激素響應(yīng)性的。與以往的研究相近，雌激素可增加靶向toll樣受體TLR3的miR-26a的表達(dá)，其雌激素抑制劑可抑制FLS中miR-26a[12]。在OA中，女性的發(fā)病率高于男性，其外泌體中的miRNA可能是性別差異發(fā)病機(jī)制的重要部分。

2.2 外泌體作為OA生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值

細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可以釋放到細(xì)胞外(如血液或體液)，它們可以反映親代細(xì)胞的生理或病理狀況，并作為不同疾病或疾病不同階段的潛在生物標(biāo)志物[21]。

研究[22]顯示關(guān)節(jié)滑膜炎癥可能是OA的超早期表現(xiàn)，其發(fā)展可能影響OA的進(jìn)展，從OA滑液中分離的外泌體可刺激巨噬細(xì)胞釋放一系列的炎癥細(xì)胞因子和CCL，包括IL-1β、MMP7、MMP12、CCL8、CCL15、CCL20等，其中IL-1β在OA滑膜液中明顯升高[20]，有利于其成為生物標(biāo)志物，而MMP12和MMP7又與OA的嚴(yán)重程度有關(guān)[23-24]，對(duì)外泌體源MMP的檢測(cè)可在一定程度上反映OA的進(jìn)展。此外，在OA的病理?xiàng)l件下，OA滑液外泌體的miR-200c含量較對(duì)照組增加2.5倍[16]，提示其可成為潛在生物標(biāo)志物。在最近的一項(xiàng)研究中，Zhao等[25]將OA患者的血漿和滑液外泌體的lncRNA進(jìn)行差異基因表達(dá)分析后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于血漿樣品，所設(shè)定三組間(早期OA組、晚期OA組、對(duì)照組)外泌體lncRNA的表達(dá)沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在滑液組中，其外泌體lncRNA PCGEM 1的表達(dá)不僅在OA患者與正常人之間存在差異，而且在OA的不同階段也有顯著差異，由于WOMAC指數(shù)與外泌體lncRNA PCGEM 1的表達(dá)密切相關(guān)并且ROC曲線下面積為0.879，提示滑液外泌體lncRNA PCGEM1可能是區(qū)分早期OA和晚期OA的有力指標(biāo)。

Tsuno等[26]比較了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、OA患者及健康捐獻(xiàn)者血清外泌體的蛋白質(zhì)譜，結(jié)果顯示在204個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)中，OA較健康對(duì)照組有21個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)顯示出不同的強(qiáng)度，其中有7個(gè)的強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步研究顯示與RA組相比，ID236(組織蛋白酶F)僅在OA組升高，而ID 325(Igα-2鏈C區(qū))僅在OA組降低。據(jù)報(bào)道[27-28]，其家族中另一個(gè)成員(組織蛋白酶K)參與OA的發(fā)病機(jī)制并可作為OA潛在生物標(biāo)志物，提示組織蛋白酶F可能參與OA的發(fā)生發(fā)展并有望成為OA外周血液中潛在分子標(biāo)志物。

2.3 外泌體作為OA治療的潛在價(jià)值

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的提倡，干細(xì)胞尤其是MSC療法備受青睞。研究顯示MSC可以通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)組織修復(fù)再生等發(fā)揮治療作用，但對(duì)其作用的方式卻各抒己見，沒有一種單一因素能自圓其說。近年來，越來越多的報(bào)道表明外泌體可作為MSC旁分泌機(jī)制在OA治療中發(fā)揮重要作用[29-30]。目前MSC來源外泌體(MSC-derived Exos，MSC-Exos)的研究大多集中于OA的治療，動(dòng)物關(guān)節(jié)內(nèi)所注射MSC-Exos可以減輕炎癥并修復(fù)軟骨組織。

Cosenza等[31]將鼠骨髓源MSC-Exos注入膠原酶誘導(dǎo)的OA模型中，發(fā)現(xiàn)其可以保護(hù)小鼠關(guān)節(jié)免受損傷，在第42天時(shí)，組織切片顯示關(guān)節(jié)軟骨中所有參數(shù)[體積、厚度、軟骨退化(表面/體積比)]顯著改善，且外觀與健康小鼠相比沒有明顯差異。體外實(shí)驗(yàn)顯示這一效應(yīng)與CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的抑制、B淋巴細(xì)胞的活化以及誘導(dǎo)M2樣抗炎巨噬細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)，而體內(nèi)研究顯示與漿母細(xì)胞數(shù)量減少和分泌IL-10的Breg細(xì)胞增加有關(guān)。Zhang等[32]的研究顯示在免疫活性大鼠股骨遠(yuǎn)端軟骨缺損模型中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射人胚胎MSC-Exos可以促進(jìn)軟骨再生。在這項(xiàng)研究中，注射的外泌體加速了新組織填充和增強(qiáng)了II型膠原及糖胺聚糖的合成，到12周時(shí)，外泌體處理的實(shí)驗(yàn)組不僅較磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)處理的對(duì)照組的組織學(xué)評(píng)分顯著改善，而且其表面的軟骨和軟骨下骨完全恢復(fù)并觀察到與年齡相匹配的天然組相似的ECM沉積。盡管該研究沒有進(jìn)一步驗(yàn)證外泌體的具體作用，但它證明了MSC-Exos在體內(nèi)具有促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用。Wang等[33]進(jìn)行類似研究，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)注射人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的MSC-Exos(embryonic stem cell-derived MSC-Exos，ESC-MSC-Exos)減輕了DMM小鼠模型中軟骨破壞和基質(zhì)降解。到術(shù)后8周時(shí)，組織學(xué)結(jié)果顯示注射PBS對(duì)照組的DMM小鼠有嚴(yán)重的纖維化和鈣化軟骨的侵蝕，而ESC-MSC-Exos組小鼠的纖維化較少，僅向淺層下方有垂直裂縫及少許表面層丟失，并且其最大和總OARSI評(píng)分均顯著低于對(duì)照組。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)顯示，這種效應(yīng)與Ⅱ型膠原合成增加及ADAMTS5的表達(dá)降低有關(guān)。這些研究都證明了外泌體可以修復(fù)動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨，同時(shí)MSC-Exos可作為無細(xì)胞療法治療OA。

Zhu等[30]比較了滑膜MSC-exos(synovial membrane-derived MSC-Exos，SMMSC-Exos)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源MSC-exos(induced pluripotent stem-derived MSC-Exos，iMSC-Exos)對(duì)OA治療的有效性，發(fā)現(xiàn)注射SMMSC-Exos和iMSC-Exos均能在膠原酶誘導(dǎo)的小鼠OA模型中減弱OA，但iMSC-Exos的治療效果更優(yōu)，因此iMSC-Exos可能代表了一種新型OA治療方法。

目前修飾后的外泌體在OA治療中也備受關(guān)注，miR-140-5p對(duì)MSC的軟骨分化至關(guān)重要，通過基因分析顯示SMMSC-140-Exos是miR-140-5p在SMMSC中過表達(dá)產(chǎn)生的一種改良外泌體，其可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，但對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響很小，并可預(yù)防大鼠模型發(fā)生OA變[34]。Sun等[35]對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體(human bone marrow-derived MSC-Exos，hBMSC-Exos)中miRNA的差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-320c的hBMSC-Exos可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖從而發(fā)揮治療OA的作用，體外實(shí)驗(yàn)顯示其作用與SOX9的上調(diào)及MMP-13下調(diào)表達(dá)有關(guān)。目前的研究顯示，各種MSC-Exos或修飾后的外泌體均可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖從而發(fā)揮治療OA的作用，但其具體作用機(jī)制尚未明確，進(jìn)一步的探索有利于為OA的精準(zhǔn)治療提供新策略。

3 結(jié)論與展望

OA的病理涉及軟骨、軟骨下骨及滑膜等組織，外泌體可作為它們的樞紐發(fā)揮傳遞通路的作用，滑液或滑膜成纖維細(xì)胞源外泌體可誘導(dǎo)OA的進(jìn)展，血清及滑液源外泌體有助于OA的診斷，不同來源MSC-Exos可通過增加軟骨細(xì)胞增殖、抑制炎癥等修復(fù)關(guān)節(jié)或延緩疾病進(jìn)展。誠(chéng)然，外泌體的這些作用將極大促進(jìn)OA機(jī)制、診斷及治療方面的研究，但同時(shí)也存在一些難題。首先，外泌體中含有大量的蛋白質(zhì)及非編碼RNA等，雖然它們參與或調(diào)控OA的發(fā)生發(fā)展，但難以準(zhǔn)確找到有貢獻(xiàn)的分子，因此未來的研究可側(cè)重于某單一成分的功能剖析及它們之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)；其次，無論是MSC-Exos還是修飾后的外泌體，都只作用于小型動(dòng)物體內(nèi)且具體的機(jī)制仍未闡明，因此它們?cè)隗w內(nèi)的安全性和有效性仍需要進(jìn)一步觀察與研究，將來可在大型動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證?？傊?，挑戰(zhàn)依然存在，但外泌體對(duì)于OA的診療作用已顯示出巨大潛力，對(duì)其進(jìn)行深入研究必將產(chǎn)生重大影響。