劉秀花,張霽,梁梁,杜風(fēng)光,馮紅,梁峰*

(1.商丘師范學(xué)院 生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘 476000;2.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476000;3.車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽 473000 )

由于化石燃料資源有限，污染環(huán)境，因此使用可再生性的生物柴油是一個(gè)最佳的選擇[1].生物柴油是再生能源，可以減少石化能源的開采和消耗、從而減少對(duì)地球生態(tài)環(huán)境的過度破壞.生物柴油燃燒所排放的CO2，遠(yuǎn)低于植物生長過程中所吸收的CO2，因此使用生物柴油，會(huì)大大降低CO2的排放和溫室氣體積累、緩解并從根本上解決因溫室氣體積累所造成的全球氣候變暖這一有害于人類的重大環(huán)境問題.我國生產(chǎn)生物柴油的原料主要是過剩的糧食，但是由于我國不適合種田的荒山和荒地巨大，而且人口眾多，所以這種方法在目前來說是行不通的，因此尋求其他途徑解決油脂來源問題是我國生物柴油發(fā)展的必由之路.微生物油脂(Microbial oils)又叫單細(xì)胞油脂(SCO)，是由酵母菌、細(xì)菌、藻類和霉菌等微生物在一定條件下，通過碳水化合物、碳氨化合物和普通油脂為碳源，將其轉(zhuǎn)化并且存在體內(nèi)的油脂，包括游離脂肪酸，長鏈脂肪醇和酯類、長鏈烯烴等[3-4].目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)油微生物主要在酵母、絲狀真菌、藻類這3種生物中[5].而且它們的生長周期短，易于大規(guī)模生產(chǎn)且基本不受地域氣候等外在條件的影響[6].

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用菌株是哈茨木霉(Trichodermaharzianum)CICC 13056，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心.由商丘師范學(xué)院生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室保存.菌種活化培養(yǎng)基使用查氏培養(yǎng)基，依照參考文獻(xiàn)[7-8]中的查氏培養(yǎng)基稍作更改，產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基依照參考文獻(xiàn)[9]配制.

1.2 研究方法

1.2.1 哈茨木霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)

把在查氏培養(yǎng)基上活化好的哈茨木霉菌株制成孢子懸液，把1×108個(gè)孢子接入滅好菌的產(chǎn)油液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件是28 ℃，180 r/min.從接入菌體以后每培養(yǎng)24 h測殘?zhí)橇亢蚿H的變化，同時(shí)蘇丹黑染色觀察油滴的變化.

1.2.2 液體發(fā)酵中pH的測定與調(diào)整

發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH是6.0，考慮到如果pH過于偏酸可能會(huì)影響到菌體的生長，甚至可能會(huì)影響到油脂的積累，所以每培養(yǎng)24 h都要用pH試紙測一下pH的變化，適當(dāng)用滅過菌的2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)整液體培養(yǎng)基的酸度.

1.2.3 阿貝折射儀測定發(fā)酵液殘?zhí)橇康臏y定

液體培養(yǎng)基的初始糖度是5.20 g/100 mL，從殘?zhí)橇恐锌梢钥闯鎏堑南?，所以每培養(yǎng)24 h用糖度計(jì)進(jìn)行殘?zhí)橇康臏y定.

1.2.4 蘇丹黑B染色顯示細(xì)胞油滴

油滴經(jīng)蘇丹黑B染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)黑色，通過觀察也能看出油滴的大小以及菌體產(chǎn)油的能力.

1.2.5 菌體生物量測定的方法

將濾紙?zhí)崆胺Q好，把搖瓶培養(yǎng)的菌體用抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾收集，做好標(biāo)記，把抽濾得到的濾餅在電子天平上依次稱量得到鮮菌重，記錄數(shù)據(jù)；用抽濾得到的鮮菌體連同濾紙放入烘箱中，60 ℃，烘1 h，即得干菌體，在電子天平上依次稱量得到干菌重，記錄數(shù)據(jù).

1.2.6 微生物油脂提取

熱酸解法提取微生物油脂依照參考文獻(xiàn)[6]、[10]報(bào)道的方法.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基菌絲體細(xì)胞油脂積累特點(diǎn)

如圖1所示，A顯示的是50 g/L蔗糖濃度的查氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)第5天的哈茨木霉的菌絲體的蘇丹黑B染色，顯微鏡觀察的油滴積累.B顯示的是在產(chǎn)油培養(yǎng)基中在自然pH的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)第5天的哈茨木霉的菌絲體的蘇丹黑B染色，顯微鏡觀察的油滴積累.C顯示的是在產(chǎn)油培養(yǎng)基中維持pH在5.5-6.0的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)第5天的哈茨木霉的菌絲體的蘇丹黑B染色，顯微鏡觀察的油滴積累(其中產(chǎn)油培養(yǎng)基中含有50 g/L葡萄糖).從圖1可以明顯看出哈茨木霉在固體查氏培養(yǎng)基中積累的油滴遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于產(chǎn)油培養(yǎng)基中積累的油滴.

圖1 菌絲體細(xì)胞油脂積累情況Fig.2 Mycelial cell lipid accumulation

圖2 不同時(shí)間不同pH菌絲體細(xì)胞油滴的蘇丹黑染色顯微圖Fig.2 Sudan black staining of mycelial cell oil droplets at different pH different times

采用產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，研究細(xì)胞油滴積累過程.由于培養(yǎng)過程中pH會(huì)發(fā)生變化，本研究設(shè)計(jì)了對(duì)發(fā)酵過程pH的調(diào)節(jié)試驗(yàn)，一組培養(yǎng)基為保持自然pH，一組使培養(yǎng)基的pH保持在5.5-6.0之間.

2.2 液體培養(yǎng)的菌絲體細(xì)胞內(nèi)油脂積累過程

圖2顯示的是液體培養(yǎng)基在自然pH的條件下培養(yǎng)72 h(A)、96 h(B)、120 h(C)、144 h(D)的染色情況和在維持pH在5.5-6.0的條件下培養(yǎng)72 h(E)、96 h(F)、120 h(G)、144 h(H)的染色情況.A到D，油滴越來越大，也越來越多；E到H，油滴越來越大，也是越來越多.由于在72 h時(shí)pH才開始調(diào)的，所以E是調(diào)pH的ck,所以E看著與不調(diào)pH的油滴情況相似.而且從圖2可以看出，調(diào)pH的積累的油滴比不調(diào)pH的積累的油滴要圓.

2.3 pH對(duì)菌體生物量的影響

圖3所示的是調(diào)pH與不調(diào)pH的生物量的影響，從圖3可以看出調(diào)pH的鮮菌重與干菌重均比不調(diào)pH的鮮菌重和干菌重要重，因此可以得出調(diào)pH的生物量高于不調(diào)pH的生物量.

2.4 培養(yǎng)過程pH調(diào)節(jié)與不調(diào)節(jié)對(duì)油脂產(chǎn)量的影響

如圖4顯示，調(diào)pH的鮮菌體產(chǎn)量和干菌體產(chǎn)量均比不調(diào)pH的鮮菌體產(chǎn)量和干菌體產(chǎn)量要高，由此可見，pH對(duì)菌體產(chǎn)量是有影響的，從圖4也可以看出鮮菌體產(chǎn)量優(yōu)于干菌體產(chǎn)量，出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是操作不當(dāng)，也有可能是提鮮菌體產(chǎn)量的方法不適合提干菌體產(chǎn)量，干菌體在一定程度上更難破碎.所以提倡用鮮菌體提油，因?yàn)檫@種方式提油節(jié)省能量、人力和時(shí)間.

圖3 pH對(duì)菌體生物量的影響Fig.3 Effect of pH on biomass

圖4 pH對(duì)油脂產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of pH on oil yield

3 結(jié) 論

通過液體發(fā)酵培養(yǎng)哈茨木霉菌株進(jìn)行蘇丹黑B染色，觀察菌絲體細(xì)胞內(nèi)油滴的積累情況，可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的增多，油滴越來越大，并且調(diào)pH的比不調(diào)pH的油滴積累的要多，要圓.通過熱酸解提取油脂的結(jié)果，可以得出哈茨木霉菌株在調(diào)pH的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，鮮菌體提取油脂產(chǎn)量為7.53 g/L，干菌體產(chǎn)油量為4.19 g/L，結(jié)果顯示干菌體提取油脂油脂提取率明顯低于鮮菌體，說明熱酸解法提取哈茨木霉有待研究.總之，本研究結(jié)果顯示哈茨木霉菌株屬于產(chǎn)油微生物，具有很好的產(chǎn)油酯能力，同時(shí)，哈茨木霉菌株在液體產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基中以及在調(diào)pH能夠促進(jìn)它的產(chǎn)油能力.