王鑫洋，陶 輝，丁季飛，徐盛松，石開虎

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1.心胸外科，2. 心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以血糖升高為特征的代謝性疾病，它最終能導(dǎo)致各種組織，包括腎、眼、心臟等一系列血管并發(fā)癥的發(fā)生[1]。心肌纖維化是一種常見的纖維化過(guò)程，其參與了心衰、房顫等多種心臟器質(zhì)性病理?yè)p傷過(guò)程[2-3]。糖尿病致心肌纖維化是導(dǎo)致糖尿病心肌病的重要病理過(guò)程之一[4]，在心肌纖維化過(guò)程中，心肌成纖維細(xì)胞和膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)起到了重要作用[5]。MicroRNA是一類長(zhǎng)為22～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過(guò)對(duì)mRNA 3′-端非編碼區(qū)的不完全互補(bǔ)結(jié)合，對(duì)其蛋白表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而參與許多重要的生理病理過(guò)程的調(diào)控[6]。其中miR-200b[7]、miR-29[8]、miR-21[9]在心肌纖維化的膠原沉積中有重要作用。有報(bào)道稱，miR-152能減弱DNMT1介導(dǎo)的甲基化，從而抑制肝纖維化[10]，但其在心臟疾病中尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，旨在探究miR-152對(duì)糖尿病心肌病的影響，為治療和干預(yù)糖尿病心肌病，延緩心肌纖維化過(guò)程，提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只健康成年SD ♂大鼠，體質(zhì)量(160～200) g；出生1～3 d的60只健康SD乳鼠，體質(zhì)量(15～25) g，均購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(皖)2017-006。

1.1.2試劑 鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)、MTT試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)；U6 qPCR試劑盒、miR-152模擬物(上海吉瑪公司)；逆轉(zhuǎn)錄引物(上海生工生物工程公司)；胰蛋白酶(美國(guó)WISENT公司)；β-actin多克隆抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)多克隆抗體、Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ，Collagen Ⅰ)多克隆抗體(武漢博士德生物公司)。

1.1.3儀器 EPS 300電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Tanon)；顯影儀、實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；varioskan LUX酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái)(智城)；生物安全柜(海爾)。

1.2 方法

1.2.1建立SD大鼠糖尿病模型 將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病組，每組各20只。糖尿病組1次性腹腔注射STZ，分別在注射后的d 3與d 7，通過(guò)大鼠尾靜脈取血測(cè)血糖，如果兩次血糖均高于11.1 mmol·L-1，則認(rèn)為大鼠造模成功。對(duì)照組注射等量生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)12周后，麻醉后處死大鼠，解剖出大鼠心臟，取部分心肌組織，多聚甲醛固定后石蠟切片，分組行HE和Masson染色，觀察心肌組織和心肌纖維化程度。剩余部分心肌組織提取蛋白和RNA，分別行Western blot檢測(cè)各組α-SMA和Collagen Ⅰ的表達(dá)，qPCR檢測(cè)各組miR-152的表達(dá)。

1.2.2乳鼠原代心肌成纖維細(xì)胞的提取和培養(yǎng) 將出生1～3 d健康乳鼠浸泡在75%酒精消毒后處死，在無(wú)菌操作臺(tái)用眼科剪、鑷子解剖出完整的小鼠心臟，去除心臟表面脂肪組織、結(jié)締組織后，用無(wú)菌預(yù)冷的PBS漂洗3遍，洗凈表面血液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中，小心剪成1 mm3大小組織塊，加入胰蛋白酶和膠原酶(比例為2 ∶1)的混合液，在37 ℃水浴鍋中充分震蕩消化15 min，用細(xì)胞篩過(guò)濾后取上層清液，加入等量的DMEM培養(yǎng)基終止消化后，900 r·min-1離心10 min，小心棄去上清液，用含血清的DMEM培養(yǎng)基吹散細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育90 min后換液，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，此時(shí)貼壁的即為心肌成纖維細(xì)胞。而后繼續(xù)培養(yǎng)至3～4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3miR-152的轉(zhuǎn)染 用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)心肌成纖維細(xì)胞，計(jì)數(shù)后等量接種于6孔板，次日待各孔中細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照說(shuō)明書配成miR-152模擬物原液，吸取10 μL，加入500 μL Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基混勻后備用；吸取LipofectamineTM2000 10 μL，加入500 μL Opti-MEM混勻后備用；將上述兩種混合液混勻后，配成miR/LipofectamineTM2000復(fù)合物，靜置30 min后加入6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h后換成正常培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48～72 h后提取RNA和蛋白質(zhì)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞分組及處理 將正常細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別行高糖(葡萄糖濃度33.3 mmol·L-1)和低糖(葡萄糖濃度5.5 mmol·L-1)培養(yǎng)，在培養(yǎng)24、48 h后提取蛋白質(zhì)和總RNA，分別行Western blot和qPCR。

1.2.5Western blot檢測(cè)組織和細(xì)胞中的目的蛋白 分別取心肌組織和細(xì)胞，置于冰上，加入RIPA裂解液和PMSF，離心后，取上清液測(cè)量蛋白濃度，而后加入蛋白上樣緩沖液100 ℃加熱5 min。冷卻后SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，8%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃搖床孵育α-SMA、Collagen Ⅰ一抗過(guò)夜，次日分別加二抗室溫孵育1 h后，采用ECL法，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

1.2.6qPCR檢測(cè)miR-152的表達(dá) 待轉(zhuǎn)染24 h后，使用TRIzol法提取總RNA，按如下步驟：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。按如下步驟行qPCR檢測(cè)miR-152的表達(dá)：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性：95 ℃ 20 s，退火：62 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增；熔解曲線階段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。最后用U6作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算各組mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。按如下步驟行qPCR檢測(cè)α-SMA和Collagen Ⅰ的表達(dá):預(yù)變性階段50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；擴(kuò)增階段95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；熔解曲線階段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s 。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.7MTT檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞增殖 取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108·L-1，而后按每孔100 μL接種于96孔板中。在培養(yǎng)24、48 h后，加入10 μL 5 g·L-1的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄液體，加入150 μL DMSO，搖床孵育10 min后，測(cè)量490 nm處吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟標(biāo)本病理學(xué)變化心肌細(xì)胞在HE染色中為紫紅色，而細(xì)胞核為紫藍(lán)色。如Fig 1所示，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，大小形態(tài)正常；糖尿病組心肌細(xì)胞排列雜亂，膠原明顯增多，細(xì)胞體積增大。Masson染色顯示心肌細(xì)胞為紫紅色，藍(lán)黑色部分為細(xì)胞核，心肌間質(zhì)膠原纖維為紫藍(lán)色。對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，大小正常；糖尿病組中膠原纖維增多，細(xì)胞大小不一，結(jié)構(gòu)消失。

2.2 大鼠糖尿病組和對(duì)照組心肌標(biāo)本α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達(dá)變化如Fig 2所示，糖尿病組大鼠心肌標(biāo)本中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。

Fig 1 HE and Masson staining(×200)

Fig 2 Expression of α-SMA and collagen Ⅰ in heart tissue of STZ

2.3 大鼠糖尿病心肌標(biāo)本中miR-152的表達(dá)變化qPCR檢測(cè)結(jié)果如Fig 3所示，糖尿病組大鼠心肌組織中miR-152的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 高糖處理乳鼠原代心肌成纖維細(xì)胞中miR-152的表達(dá)變化應(yīng)用高糖處理乳鼠原代心肌成纖維細(xì)胞，如Fig 4所示，經(jīng)過(guò)高糖刺激24 h后，miR-152的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

Fig 3 Expression of miR-152 in heart

Fig 4 Expression of miR-152 in SD

2.5 乳鼠原代心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-152模擬物后培養(yǎng)24 h，檢測(cè)miR-152的表達(dá)。如Fig 5所示，與對(duì)照組相比，miR-152模擬物組的miR-152含量明顯增多(P<0.01)。

Fig 5 Expression of miR-152 after transfect

2.6 miR-152模擬物對(duì)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞中α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示，轉(zhuǎn)染miR-152模擬物后，α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達(dá)量較空白組和陰性對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。

Fig 6 Protein expression of collagenⅠand

2.7 miR-152對(duì)細(xì)胞增殖的影響如Fig 7所示，在轉(zhuǎn)染后24、48 h行MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示，miR-152模擬物組的心肌成纖維細(xì)胞增殖水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。

Fig 7 Level of proliferation of CFs after

3 討論

糖尿病是臨床上常見的代謝性疾病，由于其并發(fā)癥眾多，常?？梢砸鹬T如心腦血管、眼底、神經(jīng)等多器官的損傷。其中，糖尿病心肌病是糖尿病的重要并發(fā)癥，而糖尿病心肌病的特征性病理變化是心肌纖維化，可導(dǎo)致心功能不全，甚至心衰[11-12]。心臟的細(xì)胞主要由心肌細(xì)胞和其周圍的心肌成纖維細(xì)胞構(gòu)成[13]。心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，心肌成纖維細(xì)胞和膠原分泌增多發(fā)揮著重要作用。高血糖的糖基化終末產(chǎn)物可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致心肌重構(gòu)[14]。

微小RNA(microRNA，miR)是一類由內(nèi)源基因編碼的，高度保守的非編碼單鏈RNA小分子，由18～25個(gè)核苷酸構(gòu)成。通過(guò)對(duì)功能蛋白的信使RNA(message RNA，mRNA)進(jìn)行降解或翻譯抑制，對(duì)其蛋白表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而參與許多重要的生理病理過(guò)程的調(diào)控。研究表明，miR-152參與纖維化疾病發(fā)生、發(fā)展，然而，miR-152在糖尿病心肌病中起何作用仍未明確。本課題通過(guò)建立糖尿病動(dòng)物模型以及高糖細(xì)胞模型，探究miR-152在糖尿病心肌病中的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，糖尿病組心肌組織相較于對(duì)照組膠原明顯增加，細(xì)胞排列紊亂。Western blot結(jié)果表明，糖尿病組α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高。qPCR結(jié)果表明，糖尿病組miR-152表達(dá)明顯低于對(duì)照組。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)高糖刺激后，qPCR結(jié)果表明miR-152的表達(dá)較低糖組明顯降低；心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-152模擬物后，α-SMA和CollagenⅠ蛋白的表達(dá)量較空白組和陰性對(duì)照組相比明顯降低；同時(shí)，MTT結(jié)果顯示，CFs轉(zhuǎn)染miR-152模擬物后，心肌成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯降低。

綜上所述，miR-152的高表達(dá)可降低α-SMA和Collagen Ⅰ等相關(guān)心肌纖維化蛋白的表達(dá)，從而抑制心肌纖維化的發(fā)生?？梢詾轭A(yù)防心肌纖維化和延緩其相關(guān)疾病，如糖尿病心肌病的進(jìn)展，甚至逆轉(zhuǎn)其病理改變提供新的思路。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助和耐心指導(dǎo)。)