付旭陽，高 麗，呂 宏，侯秋麗，陳金雙，孔令雷，石瑞麗

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040； 2.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014040；3.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006； 4.廣東省人民醫(yī)院麻醉科，廣東省 廣州市 510080；5.內(nèi)蒙古監(jiān)獄管理局第一醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 呼和浩特市 010000； 6.包頭醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040;7.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶標(biāo)研究與藥物篩選重點實驗室，北京 100050)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是病因尚未明確的、以侵蝕關(guān)節(jié)為主的全身性免疫疾病。臨床表現(xiàn)為對稱性多關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)外病理性改變，逐漸出現(xiàn)骨組織的破壞與侵蝕，導(dǎo)致關(guān)節(jié)不同程度的畸形?；颊咝枰L期服藥，藥物的副作用及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

蒙藥復(fù)方忠倫-5，別名合日呼-5湯、忠倫阿湯等，由苦參(SophoraFlavescensAit，SFA)、梔子(GardeniajasminoidesEllis，GJE)、川楝子(FructusToosendan，F(xiàn)T)、訶子(TerminaliachebulaRetz，TCR)、肋柱花(Lomatogoniumrotatum，LR)組成，出自蒙醫(yī)著作《觀者之喜》，具有清熱涼血、舒筋止痛功效，是蒙醫(yī)治療熱性黃水病、游痛證、痛風(fēng)、陳舊熱等疾病的常用方劑，傳統(tǒng)蒙醫(yī)臨床應(yīng)用本方治療RA[1]，能夠明顯改善RA患者的生活質(zhì)量，療效明確[2]。動物試驗中，忠倫-5對小鼠急性、亞急性和慢性炎癥，均有減輕炎性細(xì)胞因子對關(guān)節(jié)的刺激作用[3]。

作為“非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”的蒙醫(yī)學(xué)，經(jīng)過長時間的發(fā)展，形成了一個全面而獨特的醫(yī)學(xué)體系。然而，從分子水平來理解蒙藥方劑仍然是一大挑戰(zhàn)。隨著生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的飛速發(fā)展，“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”概念被提出，基于網(wǎng)絡(luò)的藥物研發(fā)成為一種新的高效可行的方法。通過網(wǎng)絡(luò)橋接藥物和疾病，多方向、多角度地闡述藥物治療疾病的機(jī)制。已有研究證實了該方法的可行性[4-5]。為全面闡釋蒙藥忠倫-5的作用機(jī)制，本課題擬應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法全面地解析忠倫-5治療RA的機(jī)制，為傳統(tǒng)蒙藥的研發(fā)提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 忠倫-5成分信息及作用靶點的獲取登錄TCMSP數(shù)據(jù)庫[6](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，Version：2.3)和TCMID數(shù)據(jù)庫[7](http://www.megabionet.org/tcmid/，Version：2.0)獲得苦參、訶子、梔子、川楝子、肋柱花化合物信息，并以“經(jīng)口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18”為條件篩選化合物。將化合物的2D分子結(jié)構(gòu)式輸入到Swisstarget prediction數(shù)據(jù)庫[8](http://www.swisstargetprediction.ch)中，預(yù)測化合物的作用靶點，保存靶點uniprot ID和名稱等信息。

1.2 RA相關(guān)靶點的獲得在DISGENET數(shù)據(jù)庫[9](http://www.disgenet.org/，version 5.0)中，以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，檢索與RA相關(guān)的靶點。刪除重復(fù)靶點并剔除相關(guān)性得分小于0.3的靶點，保留剩余靶點，與上述的忠倫-5靶點相匹配，得到忠倫-5治療RA的作用靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 VENNY圖的制作登錄Draw Venn Diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將各單味藥及靶點輸入在表格中，得到VENNY圖，找到5種成分共同作用的靶點。

1.4 蛋白-蛋白相關(guān)作用網(wǎng)路構(gòu)建分析將數(shù)據(jù)集的靶點信息導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[10](https://string-db.org/，Version 10.5)，種屬選擇“Homo sapiens”，獲得靶點間的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，下載相關(guān)數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Cytoscape(Version:3.2.1)軟件中，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)、拓?fù)浞治?，根?jù)自由度設(shè)置節(jié)點顏色及大小，構(gòu)建為蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物功能分析及參與通路獲得將忠倫-5治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用的靶點uniprot ID導(dǎo)入Cytoscape軟件的GO插件(Version:2.3.5)中，設(shè)置物種“Homo sapiens”選擇“GO分析、參與生物過程分析及KEGG通路分析”設(shè)置P值<0.05，提交獲得相關(guān)結(jié)果。

1.6 Hub節(jié)點選擇及分子對接驗證應(yīng)用Cytoscape軟件的cytoHubba插件，cytoHubba應(yīng)用Maximal Clique Centrality(MCC)方法，綜合11個拓?fù)浞治龇椒?Degree，Edge Percolated Component，Maximum Neighborhood Component，Densityof Maximum Neighborhood Component，Maximal Clique Centrality)和6個中心性方法(Bottleneck，EcCentricity，Closeness，Radiality，Betweenness，and Stress)，選擇關(guān)鍵靶點，找到作用于關(guān)鍵靶點的活性成分，將成分及應(yīng)對的關(guān)鍵靶點輸入Systems Dock Web Site (http://systemsdock.unit.oist.jp，Version 2.0)進(jìn)行分子對接，保存結(jié)果，根據(jù)對接得分分析活性成分與各靶點間的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1 靶點預(yù)測通過TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)集得到忠倫-5的潛在靶點，并將這些靶點與DISGENET數(shù)據(jù)庫中RA的靶點進(jìn)行對比，交集為治療RA的靶點，通過用uniprot ID獲得靶點全稱及簡寫，按“uniprot ID”及DisGeNET數(shù)據(jù)庫給出的“Probability”數(shù)值排序，得到忠倫-5治療RA的潛在靶點90個(Tab 1)。

Tab 1 Potential targets of Zhonglun-5 in treatment of rheumatoid arthritis

續(xù)表1

2.2 VENNY圖的制作為獲得5味藥的共同作用靶點，通過VENNY圖對結(jié)果進(jìn)行可視化，將各味藥及相應(yīng)的靶點通過Venn diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作VENNY圖，發(fā)現(xiàn)雌激素受體β(estrogen receptor beta，ESR2)、細(xì)胞色素P450 19A1(cytochrome P450 19A1，CYP19A1)、雄激素受體(Androgen receptor，AR)、雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)靶點為5種單味藥共同作用的靶點，且較多作為共同靶點出現(xiàn)(Fig1)。

Fig 1 Different colors represented different herbs.

2.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析考慮到疾病靶點和其它蛋白的相互作用，為全面闡釋靶點機(jī)制，將上述數(shù)據(jù)集的靶點及已有實驗證明的靶點腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及白介素6(interleukin-6，IL-6)通過STRING數(shù)據(jù)庫獲得蛋白-蛋白相互作用信息[3]，下載數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化處理及拓?fù)浞治?，根?jù)自由度設(shè)置節(jié)點顏色及大小，得到網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)。圖中蛋白節(jié)點92個，邊754個。節(jié)點顏色由白到黃，顏色越深，節(jié)點自由度越高，節(jié)點大小由自由度決定，節(jié)點自由度越高節(jié)點越大。內(nèi)圈為自由度排序為前30的節(jié)點。

2.4 GO插件分析結(jié)果通過Cytoscape中的GO插件對數(shù)據(jù)集中的靶點進(jìn)行參與生物過程分析及KEGG通路分析。生物過程分析結(jié)果表明，靶點主要富集于對活性氧的反應(yīng)(response to reactive oxygen species)、破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、糖皮質(zhì)激素生物合成過程(glucocorticoid biosynthetic process)、凋亡信號通路的正調(diào)節(jié)(positive regulation of apoptotic signaling pathway)、等多種生物過程中(Fig 3)，圖中Y軸為生物過程名稱，X軸為靶點在生物過程中的比例，各節(jié)點顏色代表P值，節(jié)點大小代表參與生物過程的靶點數(shù)；KEGG結(jié)果表明靶點參與的信號通路包括類固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)、氮代謝(nitrogen metabolism)、ABC轉(zhuǎn)運器(ABC transporters)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)等43條通路。將靶點參與通路信息導(dǎo)入到Cytoscape軟件中得到“靶點-通路”圖(Fig 4)，圖中以自由度設(shè)置節(jié)點大小，橙色通路，藍(lán)色為靶點，節(jié)點109個，邊341個，節(jié)點平均自由度為5.927。

Fig 2 Target protein interaction network of Zhonglun-5

2.5 Hub節(jié)點選擇及分子對接驗證將上述建立的“靶點-通路”圖導(dǎo)入Cytoscape軟件中，運行cytoHubba插件，對這些節(jié)點進(jìn)行排序，選取排名前8的關(guān)鍵靶點(得分大于10)，分別為絲裂原活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9，MAPK9)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)和凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2。找到與靶點對應(yīng)的活性成分包括番紅花酸(crocetin)、玫瑰樹堿(ellipticine)、水麥冬甙(triglochinin_qt)、8-異戊烯基-山奈酚(8-首先通過數(shù)據(jù)庫獲得了90個蒙藥忠倫-5抗RA的靶點，并通過STRING數(shù)據(jù)庫，獲得了這些靶點的相互作用關(guān)系，其中Akt1、IL-6、TNF、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、EGFR及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)等與多種蛋白存在聯(lián)系，這些結(jié)果與前期研究結(jié)果一致，證明了本次研究的科學(xué)性和可靠性。蛋白-蛋白相互作用結(jié)果證明這些靶點并非單獨起效，而是通過相關(guān)的作用關(guān)系、相互聯(lián)系isopentenyl-kaempferol)、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮(wighteone)、刺芒柄花素(formononetin)、苦楝子酮(melianone)、槲皮素(quercetin)和皮樹脂醇(40957-99-1)，應(yīng)用Systems Dock進(jìn)行分子對接，結(jié)果如下(Fig 5)，圖中顏色越深得分越高(最高值為8.416)。

Fig 3 Gene ontology terms for biological process of Zhonglun-5

Fig 4 Target-pathways

3 討論

Fig 5 Results of molecular docking

而產(chǎn)生效應(yīng)。隨后我們通過網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)忠倫-5主要參與氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、糖皮質(zhì)激素合成代謝、骨代謝、炎癥及凋亡等生物過程作為主要途徑作用于RA，反映出忠倫-5是多途徑的作用特點。在KEGG通路分析中，發(fā)現(xiàn)靶點參與的ras信號通路、PPAR信號通路、erbb信號通路、自噬相關(guān)通路、JAK-STAT信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、雌激素信號通路、IL-17信號通路均與RA密切相關(guān)。分析靶點-通路圖，得到蒙藥忠倫-5治療RA的Hub節(jié)點：MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，找到的活性成分包括番紅花酸、玫瑰樹堿、水麥冬甙、8-異戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮樹脂醇，最后通過分子對接確定了活性成分與靶點的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)活性成分中番紅花酸不能與關(guān)鍵靶點結(jié)合，但番紅花酸可以與其他RA相關(guān)靶點結(jié)合，且有較多研究證實其具有抗炎作用，因此番紅花酸可作為活性成分存在。靶點中的EGFR與活性成分的結(jié)合能力較低，其它靶點均可與活性成分結(jié)合。

Hub節(jié)點中MAPK8、MAPK9、MAPK14為MAPK家族成員，MAPK作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的多種生物過程，且已有以MAPK作為治療靶點的成功案例。MAPK14是p38的α亞型，其參與的p38-MAPK通路與RA發(fā)病機(jī)制中的炎癥密切相關(guān)，活化的p38通過激活下游蛋白，間接影響基因表達(dá)。有實驗證實[11]，在RA滑膜組織中，炎性因子等因素刺激使T細(xì)胞的p38異?；罨种颇[瘤壞死因子受體超家族成員6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，F(xiàn)as)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使組織中的炎癥持續(xù)存在；p38還能導(dǎo)致炎性因子、趨化因子的基因過度表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)RA的滑膜細(xì)胞炎癥的發(fā)展。MAPK8和MAPK9是JNK的1/2亞型，JNK通路被認(rèn)為與RA相關(guān)，當(dāng)JNK和JNK上游的蛋白磷酸化被抑制時，基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13，MMP13)表達(dá)都被降低[12]，而MMP-1和MMP-13是介導(dǎo)軟骨破壞的關(guān)鍵蛋白。Akt1是蛋白激酶B，現(xiàn)有研究中，Akt主要通過PI3 Kinase-Akt經(jīng)典信號途徑參與RA的發(fā)病，PI3 K/Akt通路通過激活各種下游靶蛋白，產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)[13]，且PI3 K/Akt/mTOR通路能夠調(diào)節(jié)自噬，為RA的研究熱點。STAT1和STAT3為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，在RA纖維樣滑膜細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)中均有影響[14]，此外JAK/STAT信號通路通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)基因的表達(dá)[15]，參與軟骨的破壞中。有關(guān)忠倫-5與MMPs表達(dá)的研究已有證實，但對上游的STAT的影響，還需進(jìn)一步研究。Bcl-2是與凋亡密切相關(guān)的基因，具有抗凋亡和延長細(xì)胞生命的作用。上述很多靶點及通路都作用于Bcl-2，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2作為訶子和川楝子共同的靶點，參與多種生物過程及信號通路，并且可能以抗凋亡的作用干預(yù)疾病的發(fā)展，具有一定的研究價值。

最終我們確定了忠倫-5治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要靶點MAPK9、MAPK8、Akt1、MAPK14、STAT1、STAT3、EGFR和Bcl-2，活性成分有玫瑰樹堿、水麥冬甙、8-異戊烯基-山奈酚、5,7,4'三羥基-6-異戊烯基異黃酮、刺芒柄花素、苦楝子酮、槲皮素和皮樹脂醇，本研究發(fā)現(xiàn)蒙藥忠倫-5主要通過MAPK通路、P13 K/Akt通路、JAK-STAT通路以及一些炎性因子發(fā)揮治療RA的作用。有關(guān)忠倫-5在RA中的抗炎作用既往已有一些報道，反映了本研究結(jié)果的可靠性，其它靶點及通路可作為后續(xù)研究的理論基礎(chǔ)。本研究較為全面地闡述了經(jīng)典蒙藥復(fù)方忠倫-5治療RA的靶點及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為臨床應(yīng)用該方提供了更多的理論依據(jù)，也為今后深入地研究忠倫-5的藥理作用機(jī)制提供了新的線索。