史利歡，田 亮，黃 閃，劉俊閃，王亞峰，栗春香，劉 煒

[(鄭州大學附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院(河南省小兒血液醫(yī)學重點實驗室),河南 鄭州 450000)]

伊馬替尼(imatinib，IM)作為酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，可通過競爭性與酪氨酸激酶結合，阻斷三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)對酪氨酸激酶的活化作用進而發(fā)揮抗腫瘤作用[1]，其被廣泛應用于治療Ph(+)的急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)及慢性髓細胞白血病，可明顯提高患者臨床療效及預后水平[2]，但相當部分的患者會在5年內(nèi)發(fā)生繼發(fā)TKI耐藥[3]，嚴重影響治療效果，因此明確IM耐藥發(fā)生的機制對于Ph(+)的ALL患者的治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類轉錄長度>200nt的非編碼RNA，在機體內(nèi)發(fā)揮廣泛且復雜的生物學作用，LncRNA HIT(HOXA transcript induced by TGFβ，HIT)近年被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤細胞惡性行為及進展相關[4-5]，但其在ALL中的生物學作用尚不明確。本研究通過生物信息學及體外實驗等多種手段對HIT與ALL IM抵抗的關系及相關機制進行了探究，情況如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng)人ALL細胞SUP-B15(美國ATCC，CRL-1929)，人胚胎腎細胞293T(美國ATCC，CRL-3216)，培養(yǎng)SUP-B15細胞采用10%胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco)+ 100 U·mL-1青霉素(天津藥業(yè)焦作有限公司)+100 μg·mL-1鏈霉素(國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司)的 RPMI1640(美國Thermo Fisher Scientific)培養(yǎng)液；培養(yǎng)293T細胞采用10% FBS+100 U·mL-1青霉素+100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM(美國Gibco)培養(yǎng)液。培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃，5% CO2及100%相對濕度，SUP-B15細胞室溫，1 000 rpm離心(fresco17，美國Thermo Fisher Scientific)5 min，每24 h更換培養(yǎng)液，原代細胞按1 ∶2分種傳代。

1.2 SUP-B15 IM抵抗細胞株(IM resistance，IMR)及對照組(Control)細胞株的構建1 ∶2分種傳代SUP-B15細胞，將細胞分為IMR及Control兩組，IMR組細胞采用0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 μmol·L-1IM(美國Selleck，S2475b)分步誘導，在每個IM濃度梯度下維持培養(yǎng)2周以上，待細胞生長狀態(tài)良好，進入下一濃度的篩選，直至細胞在4 μmol·L-1IM中可維持生長，繼續(xù)培養(yǎng)1周后完成IMR組細胞株的構建。同時采用等體積生理鹽水處理SUP-B15細胞作為本研究的Control細胞株。

1.3 慢病毒轉染敲降IMR細胞HIT的表達慢病毒包裝表達靶向LncRNA HIT的shRNA 1#及2#載體(蘇州吉瑪基因公司)，1 ∶2分種傳代293T細胞，接種至6孔板中，分別編號為1#及2#兩組，另取2支1.5 mL 離心管(德國Eppendorf)并編號，每管加入500 μL DMEM、1.5 μg Gag-Pol Rev expression vector(美國Addgene)及3.0 μg VSV-G expression vector(美國Addgene)，并分別加入靶向LncRNA HIT的shRNA 1#及2#載體，充分混勻后室溫靜置5 min，加入轉染試劑Lipofectamine 3000(美國Thermo Fisher Scientific)10 μL，充分混勻后室溫靜置20 min，PBS處理293T細胞3次，加入1 mL DMEM，緩慢均勻加入離心管中的混合液，6 h后PBS處理293T細胞3次，加入3 mL 10% FBS+DMEM培養(yǎng)液，48 h后收集上清液并過濾。將上清液與10% FBS+RPMI1640 1 ∶1混合后培養(yǎng)IMR細胞，連續(xù)培養(yǎng)3 d后，0.5 mg·L-1嘌呤霉素篩選細胞至其生長狀態(tài)良好，完成IMR shHIT1#及2#兩組細胞的構建。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞IM半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)培養(yǎng)待檢測對數(shù)生長期細胞，T20自動細胞計數(shù)儀(美國Bio-Rad)進行細胞計數(shù)，以1 000個細胞/孔接種待測細胞于96孔板中，細胞懸液總體積100 μL，設置0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol·L-1不同濃度的梯度IM，每組設置5個重復孔及空白對照孔，以相應濃度IM處理96孔板中的細胞24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑(日本同仁化學研究所)，并充分混勻，37 ℃，5% CO2條件下孵育2 h，SynergyH1酶標儀(美國Biotek)檢測各樣本450 nm處吸光度，以空白孔調(diào)零，計算各孔的相對吸光度。

1.5 熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR)技術檢測細胞中RNA表達水平收集對數(shù)生長期1×106左右的待檢測細胞， 1 mL TRIzol試劑(美國Invitrogen)重懸細胞抽提細胞總RNA，Nanodrop2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific)檢測RNA濃度，1 μg RNA使用逆轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific Fermentas)逆轉錄為cDNA模板，配置合成LncRNA HIT、QKI、腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)標志物Oct4及Sox2基因qPCR引物(上海生工生物工程技術服務公司，詳細序列情況見Tab 1)至工作濃度0.5 μmol·L-1，采用 SYBR Premix Ex Taq II核酸染料(日本TaKaRa)20 μL體系于Lightcycler-480Ⅱ熒光定量PCR儀(瑞士Roche)中進行qPCR反應，每組設置重復孔3個，GAPDH作為內(nèi)參基因，2(-△△CT)法計算LncRNA HIT、QKI、Oct4及Sox2 mRNA相對表達水平。

Tab 1 The primer sequence of LncRNA HIT, QKI,

1.6 蛋白免疫印跡實驗檢測細胞中蛋白的表達水平收集對數(shù)生長期5×106左右的待檢測細胞，500 μL Ripa蛋白裂解液(上海碧云天生物技術公司)4 ℃裂解細胞1 h，15 000 r·min-1，4 ℃離心細胞10 min，收集上清液于1.5 mL 離心管，BCA蛋白定量試劑盒(上海生工生物工程技術服務公司)檢測總蛋白濃度，與聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)緩沖液配置成2 g·L-1體系，煮沸變性-20 ℃保存?zhèn)溆?。配?5%聚丙烯酰胺凝膠，行PAGE，穩(wěn)壓120 V，轉PVDF膜(美國Millipore)穩(wěn)流300 mA，10%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜2 h，剪取目的條帶，1 ∶1 000的QKI抗體(anti-QKI，美國Abcam，ab126742)；Oct4抗體(anti-Oct4，美國Abcam，ab18976)；Sox2抗體(anti-Sox2，美國Abcam，ab97959)；GAPDH抗體(anti-GAPDH，美國Abcam，ab70699)室溫孵育目的蛋白分子量所對應的條帶3 h，PBS洗條帶3次后1 ∶2 000山羊抗兔IgG(sheep polyclonal to rabbit IgG H&L，美國Abcam，ab6795)室溫孵育條帶1 h，PBS洗條帶3次后ECL化學發(fā)光底物(美國Thermo Pierce)孵育條帶，ChemiDoc MP化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)對條帶印跡進行曝光顯影。

2 結果

Tab 2 Expression of LncRNA HIT, QKI, Oct4 and Sox2 mRNA in control, IMR, IMR shHIT1# and 2# cells

2.1 Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細胞IM IC50的比較Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細胞IM IC50分別為0.458±0.032、2.963±0.260、1.531±0.128及1.209±0.112 μmol·L-1，其中IMR、IMR shHIT1#及2#細胞IM IC50明顯高于Control細胞(F=34.31，ControlvsIMR q1=13.89，ControlvsshHIT1# q2=7.37，ControlvsshHIT2# q3=4.16，P均<0.05)，且IMR shHIT1#及2#細胞IM IC50明顯低于IMR細胞(IMRvsshHIT1# q4=9.73，IMRvsshHIT2# q5=6.52，P均<0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Comparison of IC50 to IM of control, IMR,IMR shHIT1# and 2# cells

2.2 Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細胞LncRNA HIT、QKI、Oct4及Sox2 mRNA表達水平及比較Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細胞LncRNA HIT、QKI、Oct4及Sox2 mRNA表達水平情況見Tab 2，統(tǒng)計學結果顯示，IMR細胞LncRNA HIT表達水平明顯高于Control細胞，IMR shHIT1#及2#細胞LncRNA HIT表達水平明顯低于IMR及Control細胞(F=56.97，ControlvsIMR q1=12.95，ControlvsshHIT1# q2=4.63，ControlvsshHIT2# q3=6.32，IMR vs shHIT1# q4=14.12，IMRvsshHIT2# q5=16.33)；IMR細胞、IMR shHIT1#及2#細胞QKI mRNA表達水平明顯低于Control細胞，而IMR shHIT1#及2#細胞QKI mRNA表達水平與IMR細胞相比無明顯變化(F=44.21，ControlvsIMR q1=13.17，ControlvsshHIT1# q2=11.52，ControlvsshHIT2# q3=13.84，IMRvsshHIT1# q4=2.38，IMRvsshHIT2# q5=1.71)；IMR細胞、IMR shHIT1#及2#細胞Oct4 mRNA表達水平明顯高于Control細胞，IMR shHIT1#及2#細胞Oct4 mRNA表達水平明顯低于IMR細胞(F=30.42，ControlvsIMR q1=13.32，ControlvsshHIT1# q2=6.23，ControlvsshHIT2# q3=4.70，IMRvsshHIT1# q4=7.08，IMRvsshHIT2# q5=8.62)；IMR細胞、IMR shHIT1#及2#細胞Sox2 mRNA表達水平明顯高于Control細胞，IMR shHIT1#及2#細胞Sox2 mRNA表達水平明顯低于IMR細胞(F=54.57，ControlvsIMR q1=17.47，ControlvsshHIT1# q2=5.00，ControlvsshHIT2# q3=5.97，IMR vs shHIT1# q4=12.47，IMRvsshHIT2# q5=11.50)。

2.3 Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細胞QKI、Oct4及Sox2蛋白表達水平及比較Control、IMR、IMR shHIT1#及2#細胞Oct4及Sox2蛋白表達水平變化與mRNA水平一致，IMR細胞、IMR shHIT1#及2#細胞QKI蛋白表達水平明顯低于Control細胞，而IMR shHIT1#及2#細胞QKI蛋白表達水平明顯高于IMR細胞，見Fig 2。

Fig 2 Expression of QKI, Oct4 and Sox2 protein in control,IMR, IMR shHIT1# and 2# cells

3 討論

LncRNA HIT基因定位于HOXA基因簇中，受轉錄生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的明顯調(diào)控，在胚胎未分化的肢體、器官等組織中表達，并參與哺乳動物的軟骨分化[6]，近年許多研究指出，HIT在多種惡性腫瘤中表達重新上調(diào)，并參與其發(fā)生發(fā)展：Richards等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)LncRNA HIT參與TGF-β誘導的乳腺癌上皮間充質(zhì)轉化過程(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，敲除HIT的表達后，TGF-β介導的小鼠乳腺癌細胞NMuMG侵襲、遷移能力均明顯下調(diào)，提示HIT在乳腺癌的EMT調(diào)節(jié)和侵襲轉移中發(fā)揮重要作用；Jia等[4]發(fā)現(xiàn)，HIT在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)組織及細胞系中高表達，且HIT表達水平與患者總生存時間負相關，與患者臨床分級及遠處轉移率正相關，體外通過慢病毒轉染法構建過表達及shRNA敲降HIT的A549及SK-MES-1細胞模型，發(fā)現(xiàn)HIT可通過維持ZEB-1蛋白的穩(wěn)定，促進NSCLC細胞侵襲轉移及EMT；Yu等[5]發(fā)現(xiàn)，LncRNA HIT過表達或敲降可明顯增加或減少NSCLC細胞增殖能力，同時明確其與轉錄因子E2F1的相互作用，進而對下游靶基因調(diào)控，發(fā)揮促進乳腺癌增殖的作用；李鑄鵬等[8]的研究顯示，LncRNA HIT在侵襲性乳腺癌組織中表達明顯升高，且與早期NSCLC患者復發(fā)及預后相關，表明了HIT與NSCLC耐藥性及發(fā)生發(fā)展具有潛在聯(lián)系。但目前有關HIT在血液腫瘤中的生物學研究仍是空白，而在前期研究中，我們通過生物信息學(http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA HIT與抑癌因子RNA結合蛋白Quaking(QKI)存在潛在的相互結合，暗示了HIT可能通過調(diào)控QKI在血液腫瘤中發(fā)揮作用。

QKI近年被許多研究報道可作為重要的抑癌因子影響多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展：Zong等[9]研究發(fā)現(xiàn)，QKI在肺癌組織中表達下調(diào)，并與患者預后時間相關，體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)過表達QKI可抑制肺癌細胞的惡性增殖，其作用機制與阻滯Notch信號通路的激活有關；Zhao等[10]研究顯示，QKI在前列腺癌組織中表達明顯降低，且其表達與腫瘤細胞分化程度、患者TNM分期及總生存率密切相關，體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)QKI可抑制前列腺癌細胞的增殖及成瘤能力；He等[11]發(fā)現(xiàn)QKI在結直腸癌組織及細胞系中表達下調(diào)，且受到微小RNA-155(MicroRNA-155)的負相調(diào)控，在結直腸癌中發(fā)揮抑制細胞周期和侵襲的作用；Lu等[12]研究發(fā)現(xiàn)QKI在口腔癌組織及口腔癌干細胞系中低表達，體外及裸鼠移植瘤實驗結果顯示QKI可通過特異性結合Sox2基因3'UTR區(qū)域阻滯Sox2的轉錄，進而抑制口腔癌細胞CSCs特性及惡性表型。QKI同樣被發(fā)現(xiàn)與血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有潛在聯(lián)系：Fang等[13]發(fā)現(xiàn)QKI是紅細胞成熟的關鍵分子，提示QKI對造血干細胞的正常分化具有重要意義，同時，Tili等[14]發(fā)現(xiàn)慢性B型淋巴細胞性白血病患者腫瘤細胞中QKI表達水平明顯下調(diào)，且通過轉基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)QKI的表達與白血病的進展明顯負相關。而CSCs則可通過原癌信號通路的激活及抗凋亡等多種途徑促進惡性腫瘤細胞包括IM在內(nèi)的多種藥物抵抗的發(fā)生[15]。由此我們提出假設：HIT是否可通過調(diào)控QKI的表達進而影響ALL細胞CSCs表型發(fā)揮生物學作用。

本研究在IM抵抗Ph(+)的ALL細胞系中發(fā)現(xiàn)LncRNA HIT表達的上調(diào)，提示HIT可能參與ALL細胞IM抵抗的發(fā)生，而采用shRNA下調(diào)IM抵抗細胞中HIT的表達后，細胞IM IC50明顯降低，表明HIT對ALL細胞IM抵抗具有促進作用，但shHIT1#及2#細胞IM IC50仍高于Control細胞，推測是由于ALL細胞IM抵抗的發(fā)生可能涉及多條信號通路，而HIT僅作為其中重要的一部分參與IM抵抗的發(fā)生。為了進一步明確HIT發(fā)揮生物學作用的相關機制，我們對可能的相互作用分子QKI的表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)IM抵抗的ALL細胞中QKI mRNA及蛋白表達水平均下調(diào)，提示QKI表達的下調(diào)與ALL細胞IM抵抗的發(fā)生密切相關，結合生物學分析結果，我們推測HIT可能與QKI存在相互作用，共同影響ALL細胞的IM抵抗，因此，我們在shHIT1#及2#細胞中檢測了QKI的表達，發(fā)現(xiàn)敲降HIT后，QKI mRNA表達水平無變化，而蛋白表達升高，表明HIT可通過負調(diào)控QKI蛋白表達水平，影響ALL細胞IM抵抗?；赒KI與腫瘤干細胞標志物表達的緊密關系，我們對相關分子Oct4及Sox2表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在IM抵抗的ALL細胞中Oct4及Sox2 mRNA及蛋白表達均明顯上調(diào)，提示IM抵抗與ALL細胞干細胞特性密切相關，而敲降HIT后Oct4及Sox2 mRNA及蛋白表達下調(diào)，表明HIT對于Oct4及Sox2的表達存在正調(diào)控作用。

綜上，我們的研究表明HIT可通過抑制ALL細胞QKI蛋白水平的表達，上調(diào)CSCs相關分子Oct4及Sox2，進而促進細胞IM抵抗能力。接下來我們將進一步探究HIT與QKI蛋白的相互結合及調(diào)控機制，并采用細胞及動物模型明確HIT在ALL中的生物學效應，為相關診斷試劑及靶向藥物在血液腫瘤中的開發(fā)及應用提供新的標志物。

(致謝：本實驗在河南省小兒血液醫(yī)學重點實驗室完成，感謝馬平、李晶、陳靜、謝昕對實驗的指導及幫助)。