鄭曉東 綜述 馬德奎 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：女性乳腺癌發(fā)病率在惡性腫瘤中排第二(208.9萬(wàn))，僅次于肺癌(209.4萬(wàn))，是女性發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤(62.7萬(wàn))[1]。近年來(lái)，人們結(jié)合大量的流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)乳腺癌的分子原因與人類晝夜節(jié)律失調(diào)相關(guān)[2]。目前研究表明晝夜節(jié)律是由至少14 種核心生物鐘基因呈晝夜節(jié)律性表達(dá)所致，包括PER-1、PER-2、PER-3、Clock、CRY1、CRY2、ARNTL 或BMAL1、TIM、ROR、NPAS2、NR1D1 和NR1D2、CSNK1E，這些基因存在于下丘腦的視交叉上核SCN(suprachiasmatic nucleus)中，在外周組織中也有表達(dá)[3]，組成了轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路[4]。其中Bmal1/Clock異源二聚體激活Per(1-3)和Cry(1、2)基因，然后Per/Cry復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中積聚后，重新定位到細(xì)胞核中，使Clock/Bmal1 反式激活失活下調(diào)其自身的表達(dá)，從而以24 h 為一個(gè)周期的表達(dá)形式控制著生物節(jié)律[5]。本文就生物節(jié)律中的核心基因Period基因與乳腺癌的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 Period基因的概述

1.1 Per 基因的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu) KONOPKA 等[6]于1971 年在果蠅的X 染色體中發(fā)現(xiàn)了Per (PerO、PerL、PerS)基因，而這3個(gè)基因的突變都會(huì)對(duì)果蠅晝夜節(jié)律有極大的影響。隨后，在鼠和人中也發(fā)現(xiàn)了類似果蠅的Per 基因，并且存在Per1、Per2、Per3 三種基因型，在SCN、腦和外周組織中均有表達(dá)，是哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)中的分子中心節(jié)律振蕩器和外周節(jié)律振蕩器的重要元件，它們?cè)诒磉_(dá)的部位和時(shí)相上存在差異。人類Per1 基因在中樞表達(dá)，Per2 基因在中樞和外周組織都有表達(dá)，Per3 基因只在胚胎期有表達(dá)[7]。Per1 基因位于染色體17p13.1p12 上，編碼含1 290 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為136 KD的蛋白；Per1基因包含一個(gè)bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PTD 區(qū)域。Per2 基因位于染色體2q37.3 上，基因長(zhǎng)度為51 529 bp，mRNA 長(zhǎng)6 342 bp，包含了23 個(gè)外顯子，它的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生含1 246 個(gè)氨基酸的Per2 蛋白，后者包含兩PAS-A 和PAS-B 兩個(gè)區(qū)域[8]。Per3 基因位于染色體1p36 上，基因長(zhǎng)度為60 475 bp，mRNA 長(zhǎng)6 203 bp，共有21 個(gè)外顯子，編碼1 201 個(gè)氨基酸。在第18 個(gè)外顯子區(qū)域存在4 個(gè)或5個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)，每個(gè)VNTR 編碼18 個(gè)氨基酸，這被稱為Per3基因的多態(tài)性[9]。

1.2 Per基因的功能 在哺乳動(dòng)物的生物節(jié)律調(diào)節(jié)中，Per 基因(至少是Per1 和Per2)起著核心的作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Per 基因后其日節(jié)律異常，但只要Per1、Per2 基因存在便能保持日節(jié)律，而Per3基因被破壞的小鼠，其日節(jié)律并不會(huì)出現(xiàn)紊亂，從而推斷Per3 基因可能不是維持日節(jié)律環(huán)路所必需的[10]。另一方面，因?yàn)镻er 基因可以下調(diào)CyclinD1、C-myc、Wee1 等細(xì)胞周期蛋白而導(dǎo)致細(xì)胞周期由G1→S 或G2→M的進(jìn)程受抑制從而調(diào)控細(xì)胞周期[11]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)基因損傷因素如放射線、細(xì)胞毒性藥物等，能誘導(dǎo)生物鐘基因Per 表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)[12]。而Per3基因中VNTR多態(tài)性與一系列睡眠和晝夜節(jié)律特征相關(guān)，包括時(shí)間類型、每日社交和活動(dòng)節(jié)律的穩(wěn)定性、總睡眠時(shí)間和“深度”非快速眼動(dòng)睡眠的量等有關(guān)[9]。正是因?yàn)镻er基因在控制生物節(jié)律、細(xì)胞周期和促進(jìn)損傷修復(fù)等方面有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，所以當(dāng)Per基因表達(dá)異常時(shí)可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

2 晝夜節(jié)律與乳腺癌

2.1 晝夜節(jié)律與乳腺癌的流行病學(xué)關(guān)系 目前許多研究已經(jīng)證實(shí)了夜班工作和癌癥之間的潛在聯(lián)系，特別是護(hù)理或服務(wù)人員晝夜顛倒排班與乳腺癌發(fā)病率的研究數(shù)據(jù)更能體現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂與乳腺癌的關(guān)系。丹麥的一項(xiàng)病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)輪班工作的服務(wù)職業(yè)女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，其危險(xiǎn)相關(guān)(OR=1.5，95%CI=1.2～1.7)[13]。國(guó)內(nèi)研究表明[14]夜間工作與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)(RR=1.20，95%CI=1.08～1.33)，無(wú)論是病例對(duì)照研究(RR=1.32，95%CI=1.17～1.50)還是隊(duì)列研究(RR=1.08，95%CI=0.97～1.21)均顯示夜間工作與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。法國(guó)學(xué)者在2005 至2008年期間開展了一項(xiàng)以人群為基礎(chǔ)的大規(guī)模病例對(duì)照研究，其結(jié)果顯示首次懷孕就開始上夜班的女性患乳腺癌的幾率更高[15]。此外，2017年發(fā)表的一項(xiàng)隨訪超過(guò)22 年的前瞻性研究顯示，對(duì)整個(gè)美國(guó)連續(xù)的局域網(wǎng)環(huán)境進(jìn)行了時(shí)變的客觀測(cè)量，發(fā)現(xiàn)生活在室外局域網(wǎng)水平高的地區(qū)的婦女侵襲性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加了14%[16]。所有這些流行病學(xué)研究都有力地表明晝夜節(jié)律的紊亂會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 生物鐘基因Per在乳腺癌中的表達(dá)情況及特征 不少研究證實(shí)了Per基因在各種癌癥中出現(xiàn)異常表達(dá)的情況，并且在某些腫瘤中Per基因的表達(dá)下調(diào)往往預(yù)示著腫瘤具有更高的惡性程度，從而推測(cè)Per基因可能是抑癌基因。包括在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[17]、腹部惡性腫瘤[18]等組織中，對(duì)腫瘤組織與鄰近正常組織比較時(shí)Per 基因均出現(xiàn)低表達(dá)的情況。臺(tái)灣學(xué)者CHEN等[19]用免疫組織化學(xué)染色方法分析了55例臺(tái)灣女性乳腺癌患者中的Per 基因(Per1、Per2、Per3)，發(fā)現(xiàn)與鄰近的非癌細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞中的三種Per 基因有超過(guò)95%的表達(dá)受到干擾。國(guó)內(nèi)張寅斌等[20]取60例手術(shù)切除或活檢乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者癌組織和癌旁組織，分別用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)Per1、Per2基因蛋白表達(dá)，與病理和臨床結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示Per1、Per2 基因在乳腺癌細(xì)胞和癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率有顯著差異(P＜0.01)。乳腺癌Per1蛋白表達(dá)和ER、PR、c-erbB2 表達(dá)、組織分級(jí)有顯著相關(guān)性；而Per2蛋白的表達(dá)與c-erbB2、組織分級(jí)有顯著相關(guān)性，證明了Per1、Per2基因表達(dá)缺失和乳腺癌發(fā)生有關(guān)，在乳腺癌發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。LESICKA等[21]利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)107例新診斷乳腺癌患者的腫瘤組織和正常組織進(jìn)行了Per基因(Per1、Per2、Per3)表達(dá)的分析，與非腫瘤標(biāo)本相比，Per1(P＜0.000 1)、Per2(P=0.037)、Per3 (P=0.001)的mRNA 水平顯著降低；在ER/PR陰性的乳腺腫瘤中Per1、Per2基因的表達(dá)明顯低于ER/PR陽(yáng)性的乳腺腫瘤。目前關(guān)于Per基因在乳腺癌中的表達(dá)研究與其在大部分癌癥中的表達(dá)相比無(wú)明顯差異，均顯示Per基因出現(xiàn)低表達(dá)的情況。

3 Period基因抑制乳腺癌的機(jī)制

3.1 啟動(dòng)子甲基化 關(guān)于Per基因在乳腺癌中出現(xiàn)低表達(dá)的機(jī)制，Per基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)備受關(guān)注。SAMULIN等[22]已經(jīng)證明，在日夜顛倒工作者中的乳腺癌患者生物鐘基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生了變化，包括與對(duì)照組相比Per1基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平升高。CHEN等[19]的研究首先揭示了Per基因的去調(diào)控不是由基因突變引起的，而是由Per1或Per2基因啟動(dòng)子甲基化引起的，且Per1 基因啟動(dòng)子甲基化與c-erbB2 表達(dá)密切相關(guān)(P=0.017)。KUO 等[23]的研究也證實(shí)了Per1、Per2基因在乳腺癌中啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化的觀點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)Per1啟動(dòng)子甲基化與≥2+的c-erbB2免疫組化反應(yīng)相關(guān)(P=0.012)，與雌激素受體陽(yáng)性呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(P=0.016)。LESICKA等[24]最新的研究發(fā)現(xiàn)從乳腺癌患者中分離的基因組DNA中，Per3(19.23%)和Per2(2.38%)的啟動(dòng)子甲基化百分比最高，其次是Per1(1.51%)，且Per因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的升高與乳腺癌的分子亞型、組織學(xué)亞型和腫瘤分級(jí)之間存在關(guān)聯(lián)。

3.2 抑制增殖 目前的研究發(fā)現(xiàn)Per 基因?qū)?xì)胞周期嚴(yán)密的調(diào)控作用，正常細(xì)胞周期是在Cyclins-CDKs-CKIs 細(xì)胞周期分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的精確調(diào)控下按嚴(yán)格的時(shí)間順序沿著G1-S-G2-M時(shí)相運(yùn)轉(zhuǎn)[25]，管理G2/M 進(jìn)展的Cdc2-cyclin B1 復(fù)合物受到CDC25磷酸酶的正調(diào)控，而受Wee1 和Myt1 激酶的負(fù)調(diào)控。GREY 等[26]的研究發(fā)現(xiàn)Per1 基因受抑制可以降低CyclinB1、Cdc2和上調(diào)Wee1的水平，可能是通過(guò)上調(diào)抑癌基因p53 途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)的，從而使癌細(xì)胞停滯在G1、G2期。Per2基因過(guò)表達(dá)以后一方面顯著下降了正向周期調(diào)控蛋白C-myc、Cyclins 的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞在G1期阻滯；同時(shí)也會(huì)直接上調(diào)Wee1 的表達(dá)或者通過(guò)上調(diào)p53 抑制CyclinB1 的表達(dá)，從而使癌細(xì)胞停滯在G2期[27,28]。Per1、Per2 基因通過(guò)這種阻滯細(xì)胞周期的作用抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

3.3 促進(jìn)凋亡 另一方面，Per基因的表達(dá)失調(diào)影響乳腺癌的發(fā)生是由于參與基因修復(fù)的調(diào)節(jié)作用。Per1、Per2基因包含在DNA損傷通路中，Per蛋白能夠與ATM(ataxia telangiectasia mutated gene)和Chk2激酶的磷酸化及非磷酸化形式結(jié)合，參與ATM→Chk2 DNA損傷信號(hào)通路，通過(guò)激活抑癌基因p53可以誘導(dǎo)細(xì)胞短暫停滯在G1期，從而使細(xì)胞有時(shí)間修復(fù)受損的DNA。不能修復(fù)的則通過(guò)上調(diào)c-Myc 抑制p53 誘導(dǎo)的p21Waf1/Cip1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡或者由p53直接與BCL-2家族成員促進(jìn)線粒體的細(xì)胞透化作用促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[26,29-31]。也有研究表明用Period3基因可以直接激活Chk2 蛋白損傷修復(fù)過(guò)程；另外，由于Per1 和Per3蛋白的核定位需要兩者的二聚化同時(shí)作用，因此Per3 的低表達(dá)可能阻止Per1 蛋白的核輸入來(lái)抑制檢查點(diǎn)的激活，在這兩個(gè)層面參與到了乳腺癌的抑制中來(lái)[32]。

4 Period基因與乳腺癌的生物時(shí)辰治療

目前惡性腫瘤的治療主要以放化療為主，而無(wú)論是化療還是放療都不可避免給患者帶來(lái)巨大的毒副作用。因腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)依靠細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，也與晝夜節(jié)律有關(guān)[33]，自HRUSHESKY 等[34]率先運(yùn)用阿霉素和順鉑對(duì)卵巢癌進(jìn)行特定時(shí)間的時(shí)辰治療以來(lái)，各項(xiàng)研究對(duì)不同系統(tǒng)的腫瘤聯(lián)合時(shí)辰放化療都獲得較好的臨床收益[35]?？赏茰y(cè)對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控起重要調(diào)控作用的Per基因在時(shí)辰治療中或?qū)⒊蔀榫薮蟮陌l(fā)現(xiàn)。且國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)乳腺癌行聯(lián)合時(shí)辰化療與常規(guī)化療比，具有療效高、副作用低的優(yōu)點(diǎn)，值得臨床推廣應(yīng)用[36]。但腫瘤的時(shí)辰治療仍處于初期，臨床治療效果的獲益性與Per基因的時(shí)間性表達(dá)相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究探索。

5 展望

Per基因在生物節(jié)律、細(xì)胞周期、惡性腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。雖然不少研究發(fā)現(xiàn)Per基因在乳腺癌組織和癌旁非癌組織中的表達(dá)有差異并影響著預(yù)后，但如何將Per基因的生物學(xué)功能更好地用于乳腺癌的臨床治療尚有許多問(wèn)題需要解決。隨著研究數(shù)據(jù)的不斷累積和豐富，期望臨床能夠闡明Per基因與乳腺癌的聯(lián)系，將有利于乳腺癌新治療策略的發(fā)展，并為指導(dǎo)時(shí)辰治療、評(píng)估疾病預(yù)后等提供依據(jù)。