何宛俞，黃積根，鄧禮勤，丁林威，張全鵬

1.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院16級生物技術(shù)本科班，海南 海口 571199；2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院17級生物技術(shù)本科班，海南 海口 571199；

3.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院18級生物技術(shù)本科班，海南 ?？?571199；

4.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院解剖學(xué)教研室，海南 海口 571199；

5.海南省熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點實驗室，海南 海口 571199

嘌呤能離子通道型受體7 (purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7R)是嘌呤受體的一個亞型，是腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)門控的非選擇性離子通道[1]，在P2XR家族中，P2X7R在炎癥細胞和抗原呈遞細胞的激活中起著重要作用[2]。

1 P2X7R的結(jié)構(gòu)和分布

P2X受體家族是由胞外ATP激活的離子化陽離子通道，允許陽離子如Ca2+、K+和Na+通過，ATP-P2X信號能使胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)組織中的離子遷移與細胞死亡[3]。人類P2X7R 定位于染色體12q24，由P2X7基因編碼P2X7R，其含有13 個外顯子，由595 個氨基酸殘基組成，有3 個同源亞基，每個亞基含有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域環(huán)和一個糖基化的胞外環(huán)，胞外環(huán)上有ATP結(jié)合位點，胞內(nèi)含有一個長鏈羧基端(C 端)和一個短鏈氨基端(N 端)，其中C 端為P2X7R 主要的功能結(jié)構(gòu)域[4]。這種受體主要表達于單核細胞、巨噬細胞[5]和哺乳類動物神經(jīng)節(jié)中的衛(wèi)星膠質(zhì)細胞[6]。

2 P2X7R的功能

2.1 P2X7R促神經(jīng)生長和促細胞增殖的作用 正常情況下，胞外ATP的濃度受到胞外ATP酶和ADP酶的嚴格調(diào)控，其濃度一直處于低水平[7]。神經(jīng)細胞受到損傷后釋放ATP，促進周圍神經(jīng)再生軸突定向的生長、促進再生軸突成熟、保護脊髓神經(jīng)元和預(yù)防失神經(jīng)支配的肌肉萎縮[8]。ATP-P2X7R 可通過MAPK/ERK 胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進細胞的增殖[9]。MAPK/ERK 通路通過多種磷酸化級聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)節(jié)多種細胞的生長和分化。同時有研究表明，周圍神經(jīng)損傷后，ATP 促進雪旺細胞的增殖，在受損神經(jīng)形成Büngner帶，促進軸突的生長和伸長[10]，干擾P2X7R基因促進巨噬細胞增殖[7]。shRNA抑制P2X7R基因抑制細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，間接提示P2X7R有促進細胞增殖和存活功能[11]。

2.2 P2X7R 與細胞損傷 細胞受到損傷時可引起P2X7R膜的通透性發(fā)生改變，如在低濃度的二價陽離子環(huán)境下，經(jīng)過高濃度激動劑的長時間或反復(fù)刺激，P2X7R的膜通透性會發(fā)生改變，陽離子通道轉(zhuǎn)變?yōu)榉沁x擇性的膜通道，可通透分子量達900 kDa左右的分子和離子[如：熒光素黃(lucifer yellow)、溴化乙錠等]。分子量較大的有機陽離子可通過這種通道進入細胞，改變了離子通透性，誘導(dǎo)細胞骨架重排，最終導(dǎo)致細胞溶胞死亡[12-13]。神經(jīng)細胞受損會導(dǎo)致ATP 的濃度增高，P2X7R膜孔形成，表達P2X7R的鄰近細胞死亡，最終導(dǎo)致壞死細胞的數(shù)量增高[14]。在P2X7R介導(dǎo)下，膠質(zhì)細胞釋放出的ATP作為神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞通訊中的信號分子，膠質(zhì)細胞受ATP刺激，其形態(tài)發(fā)生改變，P2X7R表達增加，在ATP持續(xù)刺激作用下可導(dǎo)致膠質(zhì)細胞的凋亡，從而阻止炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在[15]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化的Akt會通過磷酸化細胞內(nèi)蛋白質(zhì)來介導(dǎo)下游應(yīng)答，包括細胞的存活、生長、增殖、細胞凋亡等生物學(xué)過程[16]。當膠質(zhì)細胞受到損傷時，釋放的ATP作用于膠質(zhì)細胞上的P2X7R，使P2X7R活化，釋放谷氨酸和ATP，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性[17-18]。ATP的釋放可使膠質(zhì)細胞中細胞因子表達增強，膠質(zhì)細胞間隙連接參與了神經(jīng)保護過程，特別是谷氨酸毒性引起的損傷和保護神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激[19]。ATP通過肥大細胞釋放組胺、前列腺素，通過免疫細胞產(chǎn)生和釋放細胞因子來參與炎癥的發(fā)展[20]。

2.3 小結(jié) 有證據(jù)表明，當神經(jīng)細胞受到損傷后，其分泌的ATP 會作用于膠質(zhì)細胞膜上的P2X7R，形成ATP-P2X7R信號通路，促進神經(jīng)細胞軸突的生長和伸長，促進膠質(zhì)細胞的增殖和生長[6]。同時有文獻報道，膠質(zhì)細胞受到損傷后也會分泌ATP，促使膠質(zhì)細胞發(fā)生形變，P2X7R 的表達升高，最終導(dǎo)致膠質(zhì)細胞死亡[15]。ATP的釋放可以使膠質(zhì)細胞上的細胞因子的表達升高，可保護神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和谷氨酸毒性介導(dǎo)的細胞損傷[19]。因此，P2X7R 在周圍神經(jīng)再生中的功能尚未完全明確。

3 P2X7R 在周圍神經(jīng)再生中具體作用的研究方法

在活體動物模型中，可以通過P2X7R基因敲除來使機體分泌細胞因子和能力下降，緩解炎癥反應(yīng)[21-22]，但敲除P2X7R基因仍能夠檢測到該蛋白的陽性表達[23]。在研究腫瘤細胞時，可以通過shRNA轉(zhuǎn)染抑制P2X7R基因表達，進而抑制細胞增殖能力并誘導(dǎo)細胞凋亡[11]。在研究正常的在體細胞時，將P2X7R-shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至靶細胞，抑制P2X7R 蛋白的表達，從而促進細胞生長，提高細胞增殖活性；還可以采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定干擾P2X7R基因，該基因被抑制后，細胞生長和增殖活性明顯升高[7]。而P2X7R抑制劑BBG和激動劑2'(3')-O-(4-苯甲?；?腺苷5'-三磷酸三乙基銨鹽(Bz ATP)也是研究P2X7R功能丟失和功能獲取后觀察其功能的一種常用方法。P2X7R 抑制劑有Briliant Blue G(BBG)、AZD9056、A438079、CE224 和535[24]、oxidized ATP[25-26]，其中BBG是最常用的抑制劑，P2X7R激動劑有Bz ATP、ATP、2-MeSATP、α,β-meATP[27]，其中，研究P2X7受體功能最常用的激動劑是Bz ATP。

4 P2X7R抑制劑BBG和激動劑Bz ATP

4.1 BBG 的作用機理 P2X7 受體抑制劑BBG可拮抗抑制膠質(zhì)細胞上的P2X7R發(fā)生變構(gòu)，使ATP不能與其結(jié)合，中斷了ATP-P2X7R 的信號通路，使神經(jīng)細胞免受ATP誘發(fā)的興奮性損傷，減少炎性介質(zhì)的釋放，降低了細胞的死亡率[13，28]。P2X7受體活性通過促進細胞的存活和增殖，調(diào)節(jié)增殖和分化途徑，而抑制劑則可能導(dǎo)致分化和軸突的形成，抑制神經(jīng)元死亡率的增長[3]。這個機制意味著當ATP和P2X7R受體結(jié)合時，其他藥物就很難與該受體結(jié)合，也防止了受體和抑制劑的結(jié)合[29]。

4.2 BBG 的使用方法及優(yōu)缺點 在無菌條件下稱取1.7 g BBG，加PBS 溶液溶解后調(diào)整濃度至100 mmol/L，于-20℃儲存，用時再稀釋成100 nmol/L濃度，可用于細胞培養(yǎng)時對細胞進行干預(yù)[12]。也可用BBG 腹腔注射，劑量為5 mg/100 g[30]。BBG 具有以下優(yōu)點：(1)滲透壓和pH 值較穩(wěn)定，染色效果好；(2)不是熒光染料，不會產(chǎn)生光毒性；(3)染色所需要的濃度低；(4)是新型的生物染色劑，無生物毒性[31-33]。在配置BBG 時，微量的BBG 粉末需要用到大量的溶劑來進行稀釋，在實驗中難以把控其劑量。

4.3 Bz ATP 的作用機理 Bz ATP 是最有效的P2X7受體激動劑，Bz ATP誘導(dǎo)的痛覺過敏僅由P2X7受體激活介導(dǎo)其誘導(dǎo)劑量依賴性的機械超負荷[34]。ATP激活膠質(zhì)細胞細胞膜上P2X7受體，形成非選擇性陽離子通道，這時K+、Na+和Ca2+等離子跨膜性流動具有很強的選擇性，在這一環(huán)境下P2X7 受體的激活使離子通道擴張，形成可以允許分子量達900 kDa 左右的分子和離子通過的孔道，大分子物質(zhì)可順利通過并改變細胞的功能狀況，其始動環(huán)節(jié)是ATP 介導(dǎo)P2X7受體構(gòu)象發(fā)生了改變，形成離子通道[35-36]。

4.4 Bz ATP 的使用方法及優(yōu)缺點 在無菌條件下，5 mg Bz ATP加入PBS溶液，調(diào)整濃度至1 mmol/L，于-20℃儲存，用時再稀釋成100 μmol/L 濃度[12]。Bz ATP 腹 腔 注 射 的 劑 量 為5 μg[30]。P2X7R 激 動 劑Bz ATP(100 μmol/L)刺激細胞后，在增加細胞內(nèi)Ca2+水平和遷移的同時，既不影響細胞增殖，也不引起膜孔開放[37]。P2X7受體激動劑效價最好的是Bz ATP，該物質(zhì)是穩(wěn)定的ATP類似物，其效價遠遠大于ATP，其激活人和大鼠P2X7受體的效能是ATP的50倍[38-39]。機體的損傷可引起P2X7R活化，神經(jīng)細胞釋放大量的ATP，作用于衛(wèi)星膠質(zhì)細胞上的P2X7R并使其活化。P2X7R活化機制如下：(1)通過谷氨酸轉(zhuǎn)運體的胞吐機制從神經(jīng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運出ATP，神經(jīng)細胞內(nèi)的K+和Ca2+的遷移；(2)神經(jīng)細胞釋放ATP，其作用于衛(wèi)星膠質(zhì)細胞上的P2X7R并使其活化，促進炎癥介質(zhì)的釋放；(3)炎癥介質(zhì)的釋放直接或間接使細胞損傷、死亡和凋亡[40-41]。

5 展望

蛋白的功能可以通過其激動劑和抑制劑的干預(yù)來達到研究目的，還可以通過基因敲除來消除或減弱該蛋白的表達以及通過轉(zhuǎn)染的方式來增強該蛋白的表達。但是在體動物的模型研究中，發(fā)現(xiàn)機體的P2X7R基因并不可以完全的敲除掉，但P2X7R的基因敲除可以減弱ATP-P2X7R 信號通路而引起的炎性反應(yīng)。衛(wèi)星膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞的相互作用的機制復(fù)雜，目前尚不完全闡明清楚，本文為研究衛(wèi)星膠質(zhì)細胞P2X7R在神經(jīng)再生中的具體功能提供方法學(xué)支持。