（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066）

大腸桿菌又稱大腸埃希氏菌，為腸桿菌科埃希氏菌屬，由Escherich 在1885 年發(fā)現(xiàn)。該菌大小0.5 μm×（1～3）μm，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。絕大多數(shù)大腸桿菌對(duì)人與動(dòng)物有益，但是仍有少部分特殊類(lèi)型的大腸桿菌具有相當(dāng)強(qiáng)的毒力，一旦感染，可能會(huì)造成嚴(yán)重疫情[1]。

磺胺類(lèi)抗生素（sulfonamides，SAs）是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類(lèi)藥物的總稱，是一類(lèi)用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的化學(xué)治療藥物[2]。它通過(guò)干擾細(xì)菌的葉酸代謝而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。細(xì)菌與藥物反復(fù)接觸后，易產(chǎn)生耐藥性，磺胺類(lèi)抗生素也不例外，耐藥性嚴(yán)重影響抗生素藥物的效能。細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物和甲氧芐啶的耐藥性與五種主要機(jī)制有關(guān)，包括：（1）通透性屏障；（2）天然不敏感的固有二氫葉酸還原酶（DHFR）；（3）與葉酸途徑有關(guān)的固有二氫葉酸合成酶（DHPS）和二氫葉酸還原酶（DHFR）基因的自發(fā)突變；（4）通過(guò)上調(diào)基因表達(dá)或基因復(fù)制來(lái)增加敏感靶酶的產(chǎn)生；（5）通過(guò)整合子、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座獲得替代二氫葉酸合成酶（Sul）和二氫葉酸還原酶（dfr）基因[3-4]。迄今為止，已在革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌[5-8]中描述了4 種不同的Sul替代基因（Sul1，Sul2，Sul3和Sul4）和40種不同類(lèi)型的dfr替代基因。因此，檢測(cè)耐藥基因?qū)τ陴B(yǎng)殖生產(chǎn)中合理用藥具有良好的指導(dǎo)意義。

對(duì)于耐藥基因檢測(cè)，目前主要有藥敏試驗(yàn)[9]、PCR 檢測(cè)方法等。前者耗時(shí)耗力，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，而常規(guī)的PCR 檢測(cè)方法一次只能檢測(cè)一種耐藥基因。因此，本次研究旨在建立一種一次性檢測(cè)多個(gè)耐藥基因的省時(shí)省力檢測(cè)方法，便于及時(shí)在生產(chǎn)實(shí)踐中指導(dǎo)用藥，提高養(yǎng)殖效率。

1 材料與方法

1.1 所用菌株

試驗(yàn)用菌株由本實(shí)驗(yàn)室在生產(chǎn)豬場(chǎng)的廢棄物中分離，已經(jīng)過(guò)藥敏試驗(yàn)鑒定具有磺胺類(lèi)抗生素耐藥性。經(jīng)傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)方法確認(rèn)，同時(shí)具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因的大腸桿菌作為陽(yáng)性菌株。另外，選擇2 株已經(jīng)過(guò)藥敏試驗(yàn)鑒定，具有磺胺類(lèi)抗生素耐藥性，傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)方法已確認(rèn)不具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因的大腸桿菌作為特異性試驗(yàn)菌株。同時(shí)選擇已經(jīng)過(guò)藥敏試驗(yàn)鑒定，具有磺胺類(lèi)抗生素耐藥性的沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌作為特異性試驗(yàn)菌株。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

2×PCR Mix、Marker 等，均購(gòu)自Tiangen 公司；其他試劑均為分析純。

1.3 引物

根據(jù)Domínguez 等[10]研究成果，針對(duì)大腸桿菌Sul1和dfrA1兩個(gè)基因各設(shè)計(jì)一對(duì)引物（表1），由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究使用的引物

1.4 PCR 反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL，模板1 μL，兩種上、下游引物各0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 敏感性試驗(yàn)

對(duì)試驗(yàn)用陽(yáng)性大腸桿菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算大腸桿菌濃度。取原液，分別進(jìn)行10-1～10-5稀釋，每個(gè)稀釋度樣品各1 μL 作為模板敏感性檢測(cè)。

1.6 特異性試驗(yàn)

將傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)方法確認(rèn)，不具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因的2 株大腸桿菌和已經(jīng)過(guò)藥敏試驗(yàn)鑒定，具有磺胺類(lèi)抗生素耐藥性的沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌作為模板進(jìn)行特異性檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 有效性

通過(guò)對(duì)3 株試驗(yàn)用大腸桿菌檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，本方法能順利地檢測(cè)出Sul1和dfrA1兩種磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因（圖1）。

圖1 二重PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 敏感性

將試驗(yàn)用陽(yáng)性大腸桿菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)后，發(fā)現(xiàn)濃度為4.5×107cfu/mL。將其進(jìn)行10-1～10-5系列稀釋，每個(gè)稀釋度各取樣品1 μL 作為模板敏感性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-3稀釋度樣品仍出現(xiàn)兩個(gè)條帶，10-4和10-5兩個(gè)稀釋度樣品已無(wú)條帶（圖1）。這說(shuō)明本方法的檢出限為4.5 cfu/μL。

2.3 特異性

將經(jīng)過(guò)藥敏試驗(yàn)鑒定，具有磺胺類(lèi)抗生素耐藥性，且傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)方法已確認(rèn)不具有Sul1和dfrA1兩種磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因的2 株大腸桿菌作為模板進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并不能檢出這兩種基因。同時(shí)，也不能檢出經(jīng)藥敏試驗(yàn)鑒定，具有磺胺類(lèi)抗生素耐藥性的沙門(mén)氏菌、多殺性巴氏桿菌（圖1）。這說(shuō)明本方法對(duì)于Sul1和dfrA1兩種大腸桿菌磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因具有較強(qiáng)的檢出特異性。

3 討論

目前，已有大量關(guān)于磺胺類(lèi)抗生素耐藥性檢測(cè)的報(bào)道[3-5]，大多采用常規(guī)PCR 檢測(cè)方法，針對(duì)單一磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。這類(lèi)檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確率高，在生產(chǎn)實(shí)踐中得以廣泛運(yùn)用。然而由于這些傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)方法一次只能檢測(cè)單一磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因，對(duì)于同時(shí)檢測(cè)多種磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因，操作較為繁鎖、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究針對(duì)不同類(lèi)型的兩種磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

研究中的二重PCR 檢測(cè)比傳統(tǒng)PCR 靈敏度要低一些。這可能是由于PCR 反應(yīng)的原理決定的[11-12]。PCR 反應(yīng)中，上下游引物分別結(jié)合在模板上，指導(dǎo)DNA 聚合酶啟動(dòng)并依照模板完成DNA 合成。在二重PCR 反應(yīng)的反應(yīng)體系中存在多對(duì)引物，這些引物在結(jié)合模板時(shí)，相互競(jìng)爭(zhēng)，在模板濃度較低時(shí)，多對(duì)引物競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，必然會(huì)導(dǎo)致多重PCR檢測(cè)方法的靈敏度低。

本研究采用大腸桿菌建立了磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因二重PCR 檢測(cè)方法。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，沒(méi)有細(xì)胞壁，可直接進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，省去了提取DNA 的麻煩。對(duì)于其它細(xì)菌，除了個(gè)別革蘭氏陽(yáng)性菌，由于存在細(xì)胞壁而不能直接進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)外，操作大致是相同的。但是，本方法并不能檢出沙門(mén)氏菌和多殺性巴氏桿菌的磺胺耐藥基因，這可能是由于宿主細(xì)菌不同，而導(dǎo)致這些耐藥基因在DNA 序列上有少許的差異。因此只需要在引物序列上進(jìn)行必要的調(diào)整，就可以采用本方法對(duì)其它細(xì)菌進(jìn)行磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因檢測(cè)。

本研究建立的大腸桿菌磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因Sul1和dfrA1的二重PCR 檢測(cè)方法，特異性高、操作簡(jiǎn)單方便，為檢測(cè)此類(lèi)耐藥基因提供了有力的技術(shù)支持。