邵帥，王開秀，丁濤，姜經(jīng)航，王婷婷，劉波，江梅*

(湖北省荊門市第二人民醫(yī)院1.生殖醫(yī)學科；2.泌尿外科，荊門 448000)

近年來，隨著人們生活方式的改變，環(huán)境污染、食品安全以及手機輻射等對人類健康構(gòu)成極大威脅，導致腫瘤發(fā)病率逐年升高，而且腫瘤患者也逐漸年輕化。研究顯示僅在美國，每年就有7萬多名年齡在15歲至39歲之間的青少年和青年患者被診斷癌癥，15歲以下兒童的癌癥發(fā)病率大約為每年1萬例[1]。雖然腫瘤患者人數(shù)增多，但由于腫瘤治療技術(shù)的提升，青少年腫瘤患者的生存率日益提高，大約80%患者可以長期生存[2]。在美國每450名男性中就有1人是腫瘤幸存者，但是卻面臨著腫瘤治療導致不育的風險[3]。隨著各種治療方案的不斷改進以及相關(guān)藥物升級換代，腫瘤患者的致死率降低，生存期延長，但相關(guān)治療以及腫瘤本身對生育力有著極大的影響。因此，患者治療后對生育的需求正成為關(guān)注的熱點，而腫瘤患者生育力保障的最佳時期是在開始治療前嘗試保留生育力，同時不影響患者的治療。美國臨床腫瘤學會和歐洲腫瘤醫(yī)學會的指南均強調(diào)了腫瘤患者治療前嘗試保留生育力[4-5]。鑒于男性腫瘤患者尤其是青少年腫瘤患者的生育力問題的重要性以及迫切性，本文就腫瘤對男性生育力的影響以及男性腫瘤患者生育力保存方法做一綜述。

一、腫瘤及治療對男性生育力的影響

1.腫瘤對男性生育力的影響：腫瘤本身會影響男性生育力，導致男性少弱精子癥，甚至無精子癥。睪丸腫瘤和一些免疫或血液系統(tǒng)腫瘤(如白血病、淋巴瘤)都被認為是導致精液質(zhì)量下降的重要危險因素。研究發(fā)現(xiàn)霍奇金淋巴瘤、白血病等能損傷男性生育力，導致精液量及精子濃度顯著下降[6]。腫瘤的生長會侵襲正常的睪丸組織，影響睪丸生精功能，其機制可能與下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)控制睪丸功能有關(guān)，HPG調(diào)控正常精子生成所需的激素LH和FSH。泌乳素瘤產(chǎn)生的過多泌乳素、腫瘤多種癥狀或頭頸部惡性腫瘤均會破壞HPG軸或?qū)е滦怨δ苷系K[7]。腫瘤既能對睪丸產(chǎn)生直接影響，也可通過低表達熱休克蛋白A2(HSPA2)、Na/K-ATP酶睪丸特異性亞型(ATP1A4)、泛素-細胞色素c還原酶復(fù)合物核心蛋白2(UQCRC2)以及過表達血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)間接影響睪丸的功能[8]。腫瘤也會激活全身細胞因子介導的炎癥反應(yīng)導致發(fā)燒，引發(fā)核心體和睪丸溫度的波動，進而影響精子發(fā)生。而且腫瘤相關(guān)的情緒壓力會導致各種激素水平的改變，如兒茶酚胺、泌乳激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)等，這些變化也可能對精子發(fā)生和精子功能產(chǎn)生有害影響。再者，腫瘤患者往往會出現(xiàn)長期的飲食方式改變及身體消耗增加，這將會導致營養(yǎng)不良，維生素、礦物質(zhì)和微量元素的缺乏能夠引發(fā)精子發(fā)生障礙[9]。最近的一項研究表明單側(cè)睪丸腫瘤不僅損傷本側(cè)睪丸功能，影響精子形成，甚至影響對側(cè)睪丸的精子發(fā)生，睪丸腫瘤患者在治療前精子濃度和精子活力均較低[10]。睪丸腫瘤相關(guān)的因子，如β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)和甲胎蛋白(AFP)可能通過破壞HPG軸降低促性腺激素的生成而產(chǎn)生全身性影響以及通過影響睪丸精子發(fā)生而產(chǎn)生局部影響[11]。除此之外，睪丸腫瘤也可以通過破壞血-睪屏障導致免疫系統(tǒng)直接損傷精原干細胞以及影響局部免疫，并產(chǎn)生抗精子抗體?？咕涌贵w能夠影響精子的活力和獲能，抑制精子的頂體活性，導致頂體反應(yīng)受限影響精子穿透卵細胞放射冠，進而干擾精卵的結(jié)合受精，從而引發(fā)男性免疫性不育[12]。

2.腫瘤治療對男性生育力的影響：手術(shù)、化療和放療是治療腫瘤的主要方式，三者的聯(lián)合應(yīng)用使得腫瘤治療效果極大地改善。但每一種治療都可能會因HPG軸紊亂或者生精細胞毒性作用或者手術(shù)損傷等原因造成男性生育能力損害[13]。

睪丸切除術(shù)對生殖潛能有著直接的影響，單側(cè)睪丸切除可導致85%患者的精子濃度和精子總數(shù)降低，9%患者出現(xiàn)無精子癥[14]。經(jīng)腹股溝途徑根治性睪丸切除術(shù)是睪丸腫瘤的主要手術(shù)治療方式，術(shù)中容易造成神經(jīng)、血管、器官等損傷，而這些損傷均可導致性功能障礙。Wiechno等[15]最近研究顯示經(jīng)腹股溝途徑根治性單側(cè)睪丸切除術(shù)，術(shù)后短時間內(nèi)睪酮水平不受影響，但術(shù)后1個月泌乳素顯著降低，隨后睪酮水平下降、性腺功能減退，導致勃起功能障礙(ED)。睪丸腫瘤中絕大多數(shù)是生殖細胞腫瘤，臨床Ⅰ期睪丸非精原細胞瘤約占生殖細胞腫瘤的60%，而非精原細胞瘤常見腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此，術(shù)中建議行腹膜后淋巴結(jié)清掃術(shù)(RPLND)。既往RPLND容易損傷腹下神經(jīng)及盆腔神經(jīng)叢，術(shù)后患者都會出現(xiàn)逆行射精、ED、不育等并發(fā)癥。為減少和避免并發(fā)癥的發(fā)生，術(shù)中需要盡量避免損傷神經(jīng)，使大部分患者有射精功能，但仍然還有一部分患者會出現(xiàn)ED和逆行射精等并發(fā)癥[16]。

化療對男性生育能力的影響很大程度上取決于所用的藥物、劑量、療程和組合。化療藥物中烷基化劑生殖毒性最大，治療5年后大約25%的男性出現(xiàn)無精子癥，青春期前患者使用環(huán)磷酰胺的劑量為7.5～9.0 g/m2容易導致婚后不育，青春期后患者使用環(huán)磷酰胺劑量為10.0 g/m2(300 mg/kg)容易導致不育，劑量為19 g/m2時容易導致無精子癥[17]。臨床常用的鉑類化療藥也有相當大的生殖毒性，研究表明，使用鉑類化療藥5年后，鉑類化療藥低劑量組和高劑量組的無精子癥發(fā)生率分別為20%和47%[18]。聯(lián)合化療方案作為一些惡性腫瘤的最佳選擇，MOPP (甲氯雷他明，長春新堿，丙嗪，強的松)對血液系統(tǒng)惡性腫瘤有良好的效果，但85%的患者出現(xiàn)無精子癥、性腺功能減退癥并持續(xù)15年之久[19]。

放射治療(XRT)可以直接作用于睪丸，也可以作用于腹膜后或骨盆腫瘤，通過產(chǎn)生大量的輻射損傷睪丸并導致性腺毒性。睪丸生殖細胞和體細胞的DNA損傷程度取決于放射野的大小、劑量及放療方案。與化療類似，快速分裂的精母細胞對輻射是最敏感的，也是最早受到輻射影響，低至0.1 Gy輻射劑量都會影響精子發(fā)生；0.35 Gy輻射劑量可造成可逆性短期無精子癥；2～3 Gy輻射劑量可能造成長期影響，但有恢復(fù)的潛力；超過6 Gy輻射劑量可引起精原干細胞的完全耗竭和永久性不育[20]。

二、男性腫瘤患者生育力保存方法

1.自體精液冷凍保存：精液冷凍保存技術(shù)于20世紀60年代開始應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)中，是目前腫瘤患者生育力保存最成熟的技術(shù)。最新的美國臨床腫瘤學協(xié)會指南也建議腫瘤治療前進行精液冷凍保存。射精獲得精液進行冷凍保存是一種安全、無創(chuàng)和首選的男性生育力保存方法，手淫是最佳的取精方式。將取出的精液緩慢加入到冷凍保護劑中，通過程序化冷凍或玻璃化冷凍放入到液氮中進行冷凍保存，精液冷凍復(fù)蘇后根據(jù)精液情況進行人工授精(IUI)、體外受精-胚胎移植(IVF-ET)或者卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)等，適用于青春期后的腫瘤患者。從生物學的角度來看，精子可以無限期地儲存或者至少可以保存20年以上。研究顯示精子在液氮中儲存28年后，解凍后仍能保持良好的活力，而且能夠與透明帶正常結(jié)合[21]。兩篇關(guān)于使用冷凍20年以上的人類精子進行受精的成功案例已經(jīng)發(fā)表：1例是使用保存21年的精液進行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)已成功分娩[22]；另外1例使用儲存了28年的精液進行人工授精(IUI)也已分娩[23]。一份研究報道是用冷凍了將近40年的精液進行試管受精，移植后順利產(chǎn)下雙胞胎[24]。Huang等[25]通過分析119 558份冷凍精液標本發(fā)現(xiàn)在人類精子庫中長期冷凍儲存精液不管通過IUI還是IVF-ET并不影響臨床妊娠、流產(chǎn)或活產(chǎn)率，但超過5年的冷凍保存會影響精子的質(zhì)量。主要是因為冷凍精液會降低精子活力，增加DNA碎片率，并增加活性氧的產(chǎn)生，冷凍前加入咖啡因和褪黑激素是一種非常有效和簡單的提高精子質(zhì)量的方法[26]。對于一些無精子癥患者或因腫瘤導致的無精子癥的患者，可以通過附睪穿刺精子抽吸術(shù)、睪丸穿刺精子抽吸術(shù)以及睪丸切開顯微取精術(shù)等獲得部分精子，避免耽誤腫瘤治療，取出的微量精子可以通過微量精子冷凍法，包括空透明帶冷凍、玻璃化微滴冷凍、Cryopiece、Cell Sleeper法等，冷凍后再行ICSI受精。研究顯示非梗阻性無精子癥患者睪丸穿刺獲取的睪丸精子冷凍復(fù)蘇后行ICSI與新鮮睪丸精子相比，在受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率等均無差異[27]。

2.睪丸組織冷凍保存：青春期前男性患者的睪丸組織尚未能形成成熟精子，以及青春期后無法提供精液樣本的青少年和年輕人，可以通過取睪丸組織進行冷凍保存。睪丸組織的低溫保存為恢復(fù)生育能力提供了幾種選擇：(1)當患者需要生育時，可解凍保存的睪丸組織，將睪丸組織移植到睪丸或異位區(qū)，在體內(nèi)形成成熟的精子；(2)組織經(jīng)酶消化后獲得自體精原干細胞(SSCs)，然后再將SSCs移植到睪丸內(nèi)形成精子；(3)體外培養(yǎng)睪丸組織，使精原干細胞經(jīng)成熟分裂產(chǎn)生精子。但目前，這些方法仍處于實驗階段。

Fayomi 等[28]將青春期前雄性恒河猴睪丸組織冷凍保存后移植到恒河猴背皮或陰囊皮下，實驗發(fā)現(xiàn)，8～12個月內(nèi)移植睪丸組織生長并產(chǎn)生睪酮，并有精子形成，能夠使恒河猴的卵母細胞受精、胚胎發(fā)育、懷孕，并且產(chǎn)下健康的雌性恒河猴。而在睪丸組織的異種移植中也被證明有精子生成，Ntemou 等[29]將青春期前的狨猴睪丸組織冷凍保存，解凍后異體移植到4周齡免疫缺陷小鼠的睪丸實質(zhì)或背側(cè)皮膚下，4個月后50%的睪丸內(nèi)移植和21%的異位移植恢復(fù)睪丸功能，33%的睪丸內(nèi)移植中觀察到完整的精子發(fā)生，78%的睪丸內(nèi)移植表現(xiàn)出減數(shù)分裂后的分化(圓形精子細胞、拉長的精子細胞和精子)，每條生精小管含精原細胞較多；移植后9個月，生精小管含有更多的減數(shù)分裂后生殖細胞，沒有生殖細胞的小管較少。雖然睪丸組織移植已被證明是有效的恢復(fù)生育能力的技術(shù)，但這種技術(shù)對于患有全身性或轉(zhuǎn)移性癌癥的患者并不可行，因為殘余的惡性細胞隨時可能會傳播。

對于接受過惡性腫瘤治療的患者，可以通過消化組織、清除殘余的惡性細胞或分離SSCs和移植最后的細胞懸液來恢復(fù)生育能力。Sadri-Ardekani等[30]在繁殖培養(yǎng)過程中通過幾次傳代獲得了純化的SSCs，但這些結(jié)果還有待證實。

睪丸組織的體外培養(yǎng)技術(shù)雖然受限，但也取得了長足的發(fā)展，很多研究都描述了使用青春期前小鼠睪丸組織的冷凍復(fù)蘇后進行有機培養(yǎng)或3D培養(yǎng)分離細胞在體外完成精子形成的過程，而de Michele等[31]首次發(fā)現(xiàn)青春期前男孩睪丸組織冷凍保存，復(fù)蘇后在體外進行的有機培養(yǎng)能夠形成單倍體生殖細胞，并且減數(shù)分裂細胞和減數(shù)分裂后細胞在人體冷凍睪丸組織器官培養(yǎng)16 d后的發(fā)育。人類未成熟的睪丸組織在34℃血清替代品條件下，精原細胞和支持細胞的存活率最好。補充FSH/LH還可提高支持細胞的長期存活率和精原細胞在短期培養(yǎng)至減數(shù)分裂起始階段的成熟[32]。

這些結(jié)果在動物模型中取得了很大的進展，但還需要進一步的驗證和轉(zhuǎn)化到人類研究中。此外，還需要進一步研究，以優(yōu)化冷凍保存方案和策略，將腫瘤細胞重新引入冷凍保存的睪丸組織的風險降到最低。

3.干細胞在男性生育力保存中的應(yīng)用：干細胞 (stem cells) 是一群具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，具有自我更新和多向分化能力，能夠分化成多種功能的細胞。隨著對干細胞不斷深入研究，干細胞也逐漸應(yīng)用男性生育力方面，并且多種干細胞可以誘導精子發(fā)生，包括精原干細胞(spermatagonial stem cells，SSCs)、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stromal Cells，MSCs)、胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。

精原干細胞(SSCs)是男性生殖的基礎(chǔ)，其自我更新和分化的能力對男性生育能力至關(guān)重要，SSCs是唯一參與精子發(fā)生的干細胞。青春期前腫瘤患者在化療前將SSCs從睪丸組織分離出來冷凍保存，需要的時候再將SSCs自體移植回患者睪丸內(nèi)重啟精子發(fā)生，使患者重新獲得生育力，也可將SSCs分離出來進行體外培養(yǎng)形成精子。20多年前，Brinster等[33]第一個成功將SSC自體移植到小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生精子并產(chǎn)生后代。SSCs 數(shù)量極少，分離純化的方式較為復(fù)雜，Tian 等[34]通過免疫細胞磁珠分離法和流式細胞術(shù)從模型小鼠睪丸組織中分離純化了SSCs，將純化后的SSCs移植到B細胞急性淋巴細胞白血病模型小鼠的曲精小管中，移植的SSCs在小鼠輸精管基底廣泛定植增殖，經(jīng)過12周的SSC移植，受體睪丸組織中發(fā)現(xiàn)大量的生精細胞和精子。SSCs在體外可以通過飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法、無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法、三維細胞培養(yǎng)法等進行培養(yǎng)形成精子，Suyatno等[35]在SSCs培養(yǎng)液中添加血清替代物，體外可以培養(yǎng)2個月，并用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿發(fā)現(xiàn)能抑制睪丸組織內(nèi)其他體細胞的增殖；最近，Murdock等[36]發(fā)現(xiàn)人睪丸細胞外基質(zhì)包被培養(yǎng)皿可以有效促進人SSCs體外增殖。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)代表一類成體干細胞，主要來源骨髓、脂肪、臍帶血和組織等，也可以從包括睪丸在內(nèi)的全身血管化組織中分離出侵襲性不同的MSCs[37]。2006年Nayernia等[38]人首次報道了MSCs在體外可向生殖細胞譜系分化，他們在小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中誘導了減數(shù)分裂前期單倍體生殖細胞(GC)標記物的表達。人臍帶來源的MSCs在體外培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生支持細胞(SC)樣細胞和單倍體生殖細胞(GC)樣細胞，可以利用這些細胞的旁分泌特性來維持SSCs或促進它們在體外或體內(nèi)的分化，用于生育力保存和修復(fù)[39]。SSCs移植被認為是最有希望保持腫瘤患者生育力的技術(shù)，但移植存活率很低，這可能是由于缺乏微環(huán)境，導致移植的SSCs凋亡。MSCs在提高SSCs移植效率以及促進精子形成方面有潛在益處。骨髓MSCs產(chǎn)生旁分泌因子，可能為骨髓MSCs的形成創(chuàng)造有利的環(huán)境并可能通過協(xié)助共移植的SSCs尋找支持位和啟動分化來幫助內(nèi)源性精子形成。因此，MSCs與SSCs聯(lián)合移植在男性生殖功能恢復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

胚胎干細胞(ESCs)經(jīng)誘導可分化為三胚層的所有類型細胞，包括精子細胞，甚至形成活動的精子。人ESC體外誘導向精子分化的過程，再現(xiàn)了體內(nèi)精子的發(fā)生，同理，若體外ESCs向精子分化發(fā)生異常，可提示體內(nèi)精子發(fā)生障礙。Makoolati 等[40]將ESCs體外來源的SSCs移植到無精子癥動物模型中，移植8周后觀察到輸精管基部和受體睪丸內(nèi)的注射細胞、移植睪丸的精原細胞數(shù)和睪丸質(zhì)量均高于對照組。成纖維細胞生長因子8(FGF8)的下調(diào)可以促進ESCs向SSCs的分化，且FGF8的表達水平與MAPK/ERK信號呈正相關(guān)，F(xiàn)GF8可以通過調(diào)節(jié)細胞分化和自我更新之間的動態(tài)平衡來調(diào)控生殖細胞的命運[41]。Nayernia等[42]利用小鼠ESCs 來源的SSCs進行減數(shù)分裂，在體外產(chǎn)生單倍體的雄配子，通過卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)使小鼠卵母細胞受精，由此產(chǎn)生的雙細胞胚胎被轉(zhuǎn)移到輸卵管中，出生的7只子代中有6只發(fā)育到成年期，表明通過這種方法從胚胎干細胞中獲得的雄性配子能夠誘導正常的受精和發(fā)育。

誘導多能干細胞(iPSCs)：在精子和SSCs缺乏情況下，人類iPSCs技術(shù)可以通過利用皮膚活檢來源的成纖維細胞或其他非侵入性來源的細胞，如尿液來源的細胞或頭發(fā)角質(zhì)細胞等生成配子[43]。iPSCs可以從病人的體細胞中衍生出原始生殖樣細胞(PGCs)用于睪丸移植，誘導體內(nèi)生殖細胞發(fā)育；除此之外，在克氏綜合征和非梗阻性無精子患者中已經(jīng)衍生出iPSCs[44-45]。到目前為止，人類iPSC可分化為PGCs，且過表達DAZ 家族蛋白時，PGCs 可進入減數(shù)分裂階段，并最終形成表達精子頂體酶的單倍體精子細胞[46]。在體外從小鼠ESC和iPSC中已經(jīng)獲得PGCs，移植到小鼠卵巢和睪丸后可以活產(chǎn)[47]。iPSC的出現(xiàn)使得生殖領(lǐng)域取得了極大的進展，也為男性生育力保存提供了極大的潛力。

總結(jié)

隨著腫瘤治療技術(shù)不斷提高，腫瘤患者生存率不斷提高，患者對于生育的需求越來越強烈，但腫瘤本身及其治療都會直接或間接損傷睪丸，影響男性生育力導致不育。對于不同年齡段的腫瘤患者可以采取不同的生育保存方法，對于青春期后有生育需求的腫瘤患者，可以通過自體精液冷凍進行生育力保存；而對于青少年或者兒童腫瘤患者可以通過睪丸組織冷凍或者精原干細胞冷凍進行保存；而對于無精子癥患者則可以通過干細胞技術(shù)獲取生育力，雖然干細胞技術(shù)的研究目前處于起步階段，還有很多潛在的風險，安全性和有效性有待研究，但毫無疑問干細胞在生殖醫(yī)學領(lǐng)域中具有非常重要價值，并且具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。