張倩，王瑤，張寧，陳霞慧，趙夢思，于月新

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，沈陽 110016)

近年來我國不孕癥人數(shù)呈現(xiàn)逐年遞增趨勢，其發(fā)病機制復(fù)雜且病因多樣化。輔助生殖技術(shù) (ART) 已成為解決大部分不孕患者生育問題的治療方法，女性生殖道微生物與ART妊娠結(jié)局的關(guān)系也日益受到人們的關(guān)注。女性生殖道微生態(tài)系統(tǒng)是由多種微生物群組成的獨特的動態(tài)體系。長期以來，女性生殖道微生態(tài)主要集中在對陰道的研究。女性陰道中的微生物在陰道衛(wèi)生、性生活頻率等方面的影響下，其構(gòu)成也在發(fā)生著變化，菌群失調(diào)和致病微生物感染可能對生育及分娩產(chǎn)生影響[1-2]。有研究推測生殖道微生態(tài)的異?？赡芘c不良妊娠結(jié)局，如植入失敗、自然流產(chǎn)及早產(chǎn)等有一定相關(guān)性[3-4]，但目前對生殖道微生態(tài)進行分析的研究還很少。

隨著實驗室檢測技術(shù)的進步，研究者開始對宮頸、宮腔、卵泡液等多方面進行微生態(tài)的檢測，推翻了子宮腔內(nèi)是無菌的傳統(tǒng)理念，并證實宮腔內(nèi)有微生物的存在，且宮腔內(nèi)微生物的構(gòu)成對生育力有一定的影響。本研究通過使用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)，對接受ART助孕治療的女性患者宮腔菌群進行分析，并探討宮腔微生態(tài)改變與妊娠結(jié)局的關(guān)系。

材料與方法

一、研究對象

以2019年10～12月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI)治療并接受凍融胚胎移植(FET)的不孕患者為研究對象。

納入標準：(1)年齡<40歲；(2)移植胚胎中至少包括1枚形態(tài)學(xué)評分優(yōu)質(zhì)胚胎(7～9細胞I級D3胚胎或3BB以上的D5囊胚)；(3)無粘膜下肌瘤或內(nèi)膜息肉等宮腔占位性病變者。排除標準：(1)移植困難者；(2)輸卵管積水沒有處理或處理后仍復(fù)發(fā)；(3)中重度子宮內(nèi)膜異位癥；(4)抗磷脂綜合征等免疫性疾病、甲狀腺功能異常、嚴重系統(tǒng)性疾??；(5)薄型子宮內(nèi)膜(子宮內(nèi)膜厚度<5.0 mm)以及胚胎移植術(shù)前7 d內(nèi)查陰道分泌物提示分泌物異常者。本研究共納入238個周期。本研究經(jīng)我院倫理委員會審查批準，研究對象均簽署知情同意書(批件號：202H2019PJ005)。

二、研究方法

1.子宮內(nèi)膜準備方案：根據(jù)月經(jīng)周期是否規(guī)律主要分為自然周期和人工周期。(1)自然周期方案。對于月經(jīng)周期規(guī)律、排卵正?；颊?，采用自然周期方案，在月經(jīng)周期的第8～10天開始進行超聲評估，當優(yōu)勢卵泡的直徑為16～20 mm時，抽取外周血檢測孕酮及促黃體生成素(LH)水平，如果沒有排卵，則取消周期。(2)人工周期方案。在月經(jīng)周期第2～4天開始口服補佳樂(拜耳，德國)，初始用量為從第1～8天為4 mg/d，第9～12天調(diào)整為6 mg/d，并可根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整補佳樂劑量，當子宮內(nèi)膜厚度達到6.0 mm或更多且無優(yōu)勢卵泡生長時，肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚)40 mg/d，口服孕激素(黃體酮膠囊，浙江仙琚)200 mg/d進行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化并納入本研究。

2.樣本采集及菌群培養(yǎng)鑒定：按照規(guī)范[5]進行胚胎移植操作后，對胚胎移植導(dǎo)管的內(nèi)管尖端進行細菌培養(yǎng)，以分離培養(yǎng)出可能存在的細菌。胚胎移植時注意避免移植導(dǎo)管內(nèi)管與陰道壁及宮頸的接觸。在5% CO2、37℃有氧和厭氧環(huán)境下分別用巧克力瓊脂培養(yǎng)基(不含抗生素)(鄭州安圖生物工程股份有限公司)和血瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖生物工程股份有限公司)培養(yǎng)導(dǎo)管尖端的菌株，培養(yǎng)48～72 h。本研究培養(yǎng)微生物不包括衣原體和支原體。

3.菌落鑒定：采用MALDI-TOF(bruker microflex maldi-tof MS，布魯克，德國)及其相關(guān)配套軟件進行宮腔菌群培養(yǎng)的分析鑒定，標本制備、上機檢測及結(jié)果分析參照相關(guān)鑒定操作流程和標準化操作專家共識[6]。

4.妊娠結(jié)局判定：胚胎移植14 d之后，血HCG≥50 U/L為HCG陽性；HCG陽性者于移植后4周行超聲檢查，子宮腔內(nèi)見孕囊和原始心管搏動為臨床妊娠。

5.觀察指標：記錄研究對象的一般資料、胚胎移植情況及臨床妊娠率，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總周期數(shù)×100%。

6.分組：根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果并按宮腔內(nèi)微生物是否以乳桿菌為主要菌群分成3組，即只含乳桿菌的為乳桿菌主導(dǎo)組(n=122)、未檢測出細菌的為檢測陰性組(n=40)和同時含乳桿菌與非乳桿菌為非乳桿菌組(n=76)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、菌群培養(yǎng)結(jié)果

質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，檢出細菌的移植周期占總移植周期的83.19%(198/238)，在菌屬水平上，宮腔內(nèi)檢出的乳桿菌屬占檢出菌屬總體的57.34%，非乳桿菌屬包括鏈球菌屬、棒桿菌屬、葡萄球菌屬、加德納菌屬和腸球菌屬(表1)。

表1 宮腔菌群在菌屬水平的分布情況(%)

二、3組患者的一般資料比較

3組患者的年齡、配偶年齡、體重指數(shù)(BMI)、不孕年限、不孕類型、不孕因素、基礎(chǔ)FSH、子宮內(nèi)膜厚度及FET內(nèi)膜準備方案等比較均無顯著性差異(P>0.05)；乳桿菌主導(dǎo)組和非乳桿菌組中的抗苗勒氏管激素(AMH)均顯著低于檢測陰性組(P<0.05)，而乳桿菌主導(dǎo)組與非乳桿菌組比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、3組患者移植情況及妊娠率比較

3組患者的移植胚胎類型及移植胚胎數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)；乳酸桿菌主導(dǎo)組患者的臨床妊娠率顯著高于非乳桿菌組(P<0.01)，而檢測陰性組與非乳桿菌組比較無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

四、宮腔內(nèi)菌群與臨床妊娠結(jié)局的關(guān)系

單因素分析結(jié)果顯示，宮腔內(nèi)菌群分布差異對臨床妊娠率有顯著影響(P<0.05)，而不孕年限、BMI和不孕類型等對妊娠結(jié)局均無顯著影響(P>0.05)(表4)。

表2 三組患者的一般資料比較[(-±s)，n(%)]

表3 三組患者移植情況及妊娠比較n(%)

表4 臨床妊娠結(jié)局的單因素分析

采用多因素Logistic回歸分析宮腔內(nèi)菌群對妊娠率的影響，顯示當宮腔內(nèi)菌群為非乳桿菌時可以使臨床妊娠率顯著降低84%[OR=0.16，95%CI=(0.06，0.39)，P<0.05]，在調(diào)整女方年齡、基礎(chǔ)FSH、AMH和移植胚胎數(shù)等混雜因素后，宮內(nèi)菌群仍是影響妊娠結(jié)局的獨立危險因素87%[OR=0.13，95%CI=(0.04，0.38)，P<0.01](表5)。

表5 調(diào)整相關(guān)參數(shù)后 Logistic回歸分析宮腔內(nèi)菌群與妊娠率的關(guān)系

討 論

在人類微生物計劃 (human microbiome project，HMP) 的推動下，微生物群對人類生殖的重要性越來越被認可[7]。ART成功主要取決于患者年齡、胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性。隨著實驗室技術(shù)的發(fā)展，獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的幾率已經(jīng)大幅度提升，子宮內(nèi)膜容受性則成為提高輔助生殖結(jié)局的新突破口。女性生殖道微生物群可能會影響全身及局部的免疫[6]，從而影響到內(nèi)膜容受性[9]。女性生殖道微生物已成為近些年的研究熱點。

早期由于對微生物鑒定及取樣方面的局限性，人們認為宮腔內(nèi)是無微生物的。但隨著技術(shù)的發(fā)展，利用16s rRNA技術(shù)對子宮內(nèi)膜檢測發(fā)現(xiàn)了低生物量微生物，從而證實子宮內(nèi)確實是有菌的[9]。現(xiàn)在對于子宮微生物群的研究越來越多，但主要集中在子宮內(nèi)的微生物群對后代和新生兒免疫的影響等方面，而子宮內(nèi)膜菌群對妊娠結(jié)局以及對生殖健康的重要性往往被忽視[10]。本研究是使用MALDI-TOF MS進行菌屬鑒定，這是近年來在微生物鑒定領(lǐng)域應(yīng)用發(fā)展迅速的一種新型鑒定技術(shù)。該技術(shù)與16s rRNA測序的方法相比，雖然16s rRNA測序技術(shù)可以檢測到需要特殊培養(yǎng)的稀有菌屬，但其卻不能區(qū)分活菌或者死菌的細菌碎片。而MALDI-TOF MS則能夠檢測蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，鑒定的準確率優(yōu)于傳統(tǒng)的方法，且操作簡單、耗時時間較短，整個過程幾乎不需要額外的耗材，鑒定花費低，可對臨床樣本快速診斷，更能滿足臨床的需求[11]。

目前，病原菌影響胚胎著床的機制尚不清楚。有研究表明微生物群對免疫有影響[12-13]。如果微生物在妊娠前已經(jīng)影響了子宮的免疫環(huán)境，則會極大的影響子宮內(nèi)膜的接受能力和初始胎盤的正常形成，從而可能會導(dǎo)致不孕或胎盤功能受損。也有學(xué)者認為以非乳桿菌為主的微生物群可能會引發(fā)子宮內(nèi)膜炎，從而影響胚胎植入的成功率[14]。此外，人們還需考慮一些直接產(chǎn)生微生物的代謝物和(或酶)相關(guān)的作用機制，這些代謝物能夠產(chǎn)生相關(guān)的復(fù)合物，在子宮內(nèi)膜上皮誘導(dǎo)關(guān)鍵的細胞通路。在胚胎著床期，需要子宮內(nèi)膜與囊胚之間正確的相互作用，滋養(yǎng)細胞的遷移與血管重構(gòu)的潛在機制可能與內(nèi)膜有關(guān)，如果微生物及其代謝物在復(fù)雜的子宮環(huán)境中影響了任何一種生理作用，都可能影響胚胎著床。

Tao等[15]通過評估從70名行IVF-ET患者導(dǎo)管尖端獲得的微生物群，檢測到大量乳桿菌，其次還有棒桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和雙歧桿菌等。Franasiak等[16]通過對33名接受輔助生殖助孕婦女在ART期間胚胎移植導(dǎo)管尖端獲得子宮內(nèi)膜微生物組進行的研究，也證實了乳桿菌是最豐富的菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)接受ART的不孕癥女性宮腔內(nèi)菌群優(yōu)勢菌屬主要為乳桿菌屬，與上述研究結(jié)果一致。在子宮內(nèi)膜容受期宮腔內(nèi)菌群的分布與妊娠結(jié)局相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)。當移植時宮腔內(nèi)微生態(tài)以非乳桿菌為主時妊娠率顯著降低(P<0.05)，調(diào)整模型中影響臨床妊娠率的相關(guān)因素后進行多因素Logistic分析發(fā)現(xiàn)，未調(diào)整和調(diào)整模型未顯著改變相關(guān)結(jié)果[OR=0.13，95%CI=(0.04，0.38)，P<0.01]，提示宮腔內(nèi)菌群為非乳桿菌是影響輔助生殖結(jié)局的獨立危險因素。這與以往大部分的研究結(jié)果是一致的[17-22]。但也有研究者發(fā)現(xiàn)以乳桿菌為主的宮腔內(nèi)環(huán)境并不能改善妊娠結(jié)局[23]。因此，兩者關(guān)聯(lián)性仍需探討。同時，我們也發(fā)現(xiàn)宮腔內(nèi)檢測陰性組妊娠率高于非乳桿菌主導(dǎo)組(65.00% vs 36.84%)，Logistic分析發(fā)現(xiàn)，檢測陰性組與臨床妊娠之間有顯著的相關(guān)性(P<0.05)，提示即使未檢出乳桿菌的存在，妊娠也是有可能的，但次于以乳桿菌為主導(dǎo)組。

綜上所述，ART結(jié)局受諸多因素影響，宮腔內(nèi)異常菌群的存在可能影響妊娠結(jié)局。其機制尚需深入研究，可為今后不孕癥的臨床決策提供依據(jù)和新思路。