張 倩,劉曉朋,張 旭,洪 波,季軍遠(yuǎn)??

(1.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.齊魯交通服務(wù)開(kāi)發(fā)集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)南 250000)

高鹽為工業(yè)廢水常見(jiàn)特征，如味精生產(chǎn)廢水、制革廢水、稀土冶煉廢水、海產(chǎn)品加工廢水等。高鹽會(huì)破壞微生物的細(xì)胞膜和菌體內(nèi)酶系統(tǒng)，對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制或?qū)е缕渌劳鯷4]。微生物是廢水生物處理工藝高效穩(wěn)定的根本，耐鹽型功能菌的獲取成為厭氧氨氧化工藝成功應(yīng)用于高鹽工業(yè)廢水脫氮治理的關(guān)鍵。相關(guān)研究得出海洋系統(tǒng)中存在豐富的厭氧氨氧化菌，為最理想的耐鹽型厭氧氨氧化菌源。馮莉等[5]通過(guò)接種膠州灣底泥，采用厭氧序批式反應(yīng)器(Anaerobic sequencing batch reactor，ASBR)反應(yīng)器經(jīng)192天成功富集培養(yǎng)出海洋厭氧氨氧化菌(Anaerobic ammonium oxidizing bacterium，AnAOB)。厭氧氨氧化菌為自養(yǎng)菌，生長(zhǎng)速率緩慢，細(xì)胞產(chǎn)率低，直接從海洋中獲取可工程應(yīng)用的功能菌難以實(shí)現(xiàn)。鑒于已存在較為廣泛的淡水型厭氧氨氧化菌源，對(duì)其逐步鹽度馴化提高其耐鹽性成為獲取的最佳途徑。國(guó)內(nèi)外研究者[6-8]開(kāi)展了鹽度對(duì)淡水型厭氧氨氧化工藝性能及菌群結(jié)構(gòu)影響研究，鹽度對(duì)工藝穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，厭氧氨氧化菌經(jīng)鹽馴化后其耐鹽型增強(qiáng)，優(yōu)勢(shì)菌群相應(yīng)變化。

ANAMMOX工藝耐鹽馴化調(diào)控模式的不同直接影響其對(duì)高鹽的耐受性，影響工藝脫氮效能。Chen等[9]研究了不同管理策略的高鹽環(huán)境下厭氧氨氧化反應(yīng)器的性能；鄧雄文等[10]考察了定鹽濃度(18 g·L-1)逐步提升氮負(fù)荷調(diào)控模式對(duì)厭氧氨氧化工藝脫氮性能影響，得出此鹽度下工藝對(duì)負(fù)荷的承載力減弱，負(fù)荷提升難度大，且反應(yīng)器性能恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)；陸慧鋒[11]研究考察了高、低負(fù)荷下鹽度馴化效果，得出低負(fù)荷條件下逐步提升鹽度的馴化模式較高負(fù)荷條件下鹽度馴化效果優(yōu)，低負(fù)荷下馴化可加快厭氧氨氧化菌對(duì)高鹽的適應(yīng)，更利于獲取高效耐鹽功能菌群的結(jié)論。而至今對(duì)低負(fù)荷下鹽馴化對(duì)AnAOB中胞外聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)特性影響研究較少。EPS在促進(jìn)微生物聚集體形成、提升反應(yīng)器污泥濃度，提高污染物去除以及抵抗沖擊負(fù)荷等方面發(fā)揮著重要作用。Ma等[12]的研究表明，厭氧氨氧化菌的EPS含量隨鹽度提升而增加；Xing等[13]研究表明，鹽度沖擊引起AnAOB的EPS總量較原來(lái)增加2.58倍；Liu等[14]的研究表明,EPS產(chǎn)生量少的微生物具有較差的耐鹽性。微生物可通過(guò)分泌更多EPS增強(qiáng)其對(duì)滲透壓的抵抗能力，抵御高鹽對(duì)功能微生物活性的抑制[15]。研究較優(yōu)馴化模式(低負(fù)荷下鹽度馴化)下鹽脅迫對(duì)AnAOB中EPS特性影響可闡明AnAOB對(duì)鹽度的刺激響應(yīng)過(guò)程，進(jìn)一步明晰ANAMMOX工藝應(yīng)用于高鹽含氮廢水脫氮過(guò)程的特征變化?；诖?，本文開(kāi)展了低容積負(fù)荷下鹽脅迫對(duì)厭氧氨氧化污泥EPS特性影響研究，以期為工藝的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)裝置

本試驗(yàn)采用上流式厭氧污泥床(Upflow anaerobic sludge blanket，UASB)反應(yīng)器作為試驗(yàn)裝置(見(jiàn)圖1)，反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成，呈圓柱狀，總?cè)莘e為3.5 L，有效容積為1.4 L，其中反應(yīng)區(qū)內(nèi)徑6 cm，高度為50 cm。廢水經(jīng)由蠕動(dòng)泵連續(xù)泵入反應(yīng)器底部進(jìn)水口，經(jīng)反應(yīng)區(qū)中厭氧氨氧化污泥降解且經(jīng)三相分離器分離后，通過(guò)上部出水口外排。反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的氣體從反應(yīng)器頂部排氣孔排出。試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)恒溫水浴維持反應(yīng)器工作溫度為(35±1) ℃，反應(yīng)器外裹黑布以避免光照的不利影響。

1.2 接種污泥

試驗(yàn)所用厭氧氨氧化絮體污泥取自山東某污水處理廠剩余污泥脫濾液厭氧氨氧化脫氮處理裝置，SS為16.6 g·L-1，VSS為10.0 g·L-1，VSS/SS為0.60。UASB反應(yīng)器污泥接種量為1.2 L。

1.3 試驗(yàn)廢水

(1.進(jìn)水箱Influent tank；2.蠕動(dòng)泵Peristaltic pump；3.取樣口Sample ports；4.出水箱Effluent tank；5.出水口Effluent outlet；6.排氣口Biogas。)
圖1 試驗(yàn)裝置示意圖
Fig.1 Schematic diagram of experimental equipment

表1 微量元素組成Table 1 Composition of trace elements

1.4 分析項(xiàng)目及測(cè)定方法

胞外聚合物(EPS)提取與測(cè)定：參照Wang等[17]的方法分層提取松散型胞外聚合物(Loosely bound EPS，LB-EPS)與緊密型胞外聚合物(Tightly bound EPS，TB-EPS)。采用硫酸-蒽酮比色法[18]測(cè)定多糖(Polysaccharide，PS)含量，采用改進(jìn)的Folin-酚試劑法[19]測(cè)定蛋白質(zhì)(Protein，PN)的含量。

三維熒光光譜[20-21](Three-dimensional excitation-emission matrix fluorescence spectroscopy，3D-EEM)：采用熒光光度計(jì)(F-4600,Hitachi,Japan)測(cè)定樣品中LB-EPS和TB-EPS的三維熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(Em)的掃描范圍分別為200～450和240～550 nm，掃描間隔為5 nm，掃描速度采用1 200 nm/min。用超純水作為空白樣品校正水的拉曼散射。

紅外光譜[20-21](Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)：將經(jīng)-35 ℃下冷凍干燥處理后的LB-EPS和TB-EPS與干燥的溴化鉀(KBr)粉末按1∶100比例研磨混合并壓制成半透明薄片，利用傅里葉變換紅外光譜儀(Tensor 27,Bruker Optics,Germany)在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)定其紅外光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽脅迫下ANAMMOX工藝脫氮性能

圖2 鹽濃度對(duì)出水濃度及TN去除率的影響Fig.2 The effect of salinity on the effluent concentration of and the TN removal efficiency

試驗(yàn)維持反應(yīng)器氮容積負(fù)荷(Nitrogen loading Rate，NLR，kg·(m3·d)-1)恒定((0.47±0.02) kg·m-3·d-1)。不同鹽濃度條件下ANAMMOX工藝氮去除負(fù)荷(Volume substrate nitrogen removal rate，NRR，kg·(m3·d)-1)及化學(xué)計(jì)量比見(jiàn)圖3。由圖可知，鹽濃度為5 g·L-1階段(第1～19天)，氮去除速率(NRR)相較于無(wú)鹽工況下NRR(0.40 kg·m-3·d-1)呈輕微下降，為0.38 kg·m-3·d-1；當(dāng)鹽濃度提升至10 g·L-1后(第20～25天)，NRR維持穩(wěn)定，為0.36 kg·m-3·d-1；自第26天起，鹽濃度提升至15 g·L-1(第26～35天)，反應(yīng)器脫氮性能出現(xiàn)惡化，NRR急劇下降，由0.36降至0.25 kg·m-3·d-1；第36天起，將鹽濃度由15 g·L-1降低至10 g·L-1，以期恢復(fù)反應(yīng)器脫氮性能，NRR仍繼續(xù)惡化，降至0.18 kg·m-3·d-1，從第48天開(kāi)始，鹽濃度對(duì)ANAMMOX菌抑制作用減弱，NRR開(kāi)始穩(wěn)步增加，至第59天時(shí)NRR已升至0.36 kg·m-3·d-1，已恢復(fù)至抑制作用前NRR值。之后分兩階段(13和15 g·L-1)提高鹽濃度，NRR基本維持穩(wěn)定，為0.37 kg·m-3·d-1，此鹽濃度下對(duì)ANAMMOX抑制作用大大減弱，功能菌已呈現(xiàn)相應(yīng)的耐鹽性。

圖3 鹽濃度對(duì)NRR及化學(xué)計(jì)量比的影響Fig.3 Effect of salinity on NRR and stoichiometric ratio

2.2 鹽脅迫下胞外聚合物含量及特性

不同鹽濃度下ANAMMOX污泥中EPS含量及組分特征見(jiàn)圖4。由圖可知，隨鹽濃度提升污泥中EPS含量逐漸增加。在鹽濃度分別為0、5、10、15 g·L-1時(shí)，EPS含量分別為8.00、8.91、9.68、13.35 mg·g-1VSS，各鹽濃度工況下EPS含量相較于無(wú)鹽工況下分別增加了11.3%、21.0%、66.9%，隨鹽濃度不斷提升，其抵御鹽脅迫而分泌產(chǎn)生的EPS含量與鹽濃度成正相關(guān)(R2=0.86)。各鹽濃度工況下EPS分層組成中，均以TB-EPS為主，TB-EPS占比分別為92.2%、81.6%、71.1%、79.9%，相較于無(wú)鹽工況，鹽濃度會(huì)降低TB-EPS占比。在鹽濃度分別為0、5、10、15 g·L-1時(shí)，在LB-EPS中PN/LB-EPS值分別為64.5%、82.8%、74.6%和85.9%，在TB-EPS中PN/TB-EPS值分別為90.6%、95.6%、91.1%和87.2%，各分層EPS中均以PN為主，表明蛋白質(zhì)在厭氧氨氧化微生物對(duì)鹽脅迫應(yīng)答過(guò)程中起關(guān)鍵作用，與ANAMMOX中EPS相關(guān)研究結(jié)論一致[24]。分析單一組分含量，在鹽濃度分別為0、5、10、15 g·L-1時(shí)，總蛋白含量分別為6.91、8.58、8.36和11.61 mg/(g VSS)，總多糖的含量分別為1.09、0.62、1.33、1.74 mg/(g VSS)，總蛋白的含量顯著增加，而總多糖含量?jī)H有輕微增加，這與楊明明等[20]的研究結(jié)果相似。

圖4 鹽濃度對(duì)LB-EPS和TB-EPS、PN和PS含量的影響Fig.4 Effect of salinity on LB-EPS and TB-EPS content and PN and PS

2.4 鹽脅迫下EPS熒光特性

圖5為不同鹽濃度下LB-EPS和TB-EPS三維熒光光譜圖。表2為不同鹽濃度下LB-EPS和TB-EPS中各組分三維熒光光譜參數(shù)。由圖5可知，不同鹽濃度下各EPS中共出現(xiàn)4個(gè)熒光峰，分別為熒光峰A(220～240 nm/335～340 nm)、熒光峰B(275～295 nm/335～340 nm)、熒光峰C(270～275 nm/440～445 nm)，其中熒光峰A和熒光峰B均存在于各鹽濃度工況的LB-EPS、TB-EPS中。參考相關(guān)文獻(xiàn)可確定熒光峰A為芳香族蛋白類物質(zhì)，熒光峰B為色氨酸蛋白類物質(zhì)，熒光峰C為富里酸類物質(zhì)[25]。鹽濃度分別為0、5、10、15 g·L-1時(shí)，LB-EPS與TB-EPS組分均以蛋白質(zhì)組分為主，且蛋白質(zhì)主要組成為芳香族蛋白類和色氨酸蛋白類(峰A和峰B)。LB-EPS中，鹽濃度為5 g·L-1工況較無(wú)鹽工況，芳香族蛋白類物質(zhì)(峰A)強(qiáng)度較色氨酸蛋白類物質(zhì)(峰B)峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，結(jié)合圖4可知，5 g·L-1鹽濃度下LB-EPS中PN含量較無(wú)鹽下大幅增長(zhǎng)主要由芳香族蛋白類物質(zhì)引起。5與10 g·L-1鹽濃度下，色氨酸蛋白類物質(zhì)(峰B)峰強(qiáng)度接近或略高于芳香族蛋白類物質(zhì)(峰A)，但當(dāng)鹽濃度為15 g·L-1時(shí)，色氨酸蛋白類物質(zhì)(峰B)峰強(qiáng)度明顯低芳香族蛋白類物質(zhì)(峰A)，且同時(shí)出現(xiàn)富里酸類物質(zhì)，表明15 g·L-1鹽濃度已影響AnAOB生長(zhǎng)，造成功能菌分解，此過(guò)程可能將色氨酸蛋白類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為富里酸類物質(zhì)[20]；而同樣鹽濃度下，TB-EPS熒光圖譜中并未出現(xiàn)峰C，表明此鹽濃度僅使外層EPS(LB-EPS)通過(guò)組分調(diào)整應(yīng)答鹽脅迫影響，尚未引起內(nèi)層EPS(TB-EPS)中組分發(fā)生改變，但具體機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。結(jié)合TB-EPS三維熒光圖譜與TB-EPS中PN、PS含量分析(見(jiàn)圖4)可得，5 g·L-1鹽濃度下TB-EPS中PN含量增長(zhǎng)主要由色氨酸蛋白類物質(zhì)引起。相同鹽濃度下LB-EPS與TB-EPS熒光強(qiáng)度對(duì)比可得，EPS 中組成主要以TB-EPS為主，且各分層EPS的組成成分均主要為類蛋白物質(zhì)，與前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(見(jiàn)圖4)。

圖5 不同鹽濃度下LB-EPS和TB-EPS的三維熒光光譜Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of LB-EPS and TB-EPS under different salinities

表2 不同鹽濃度下LB-EPS和TB-EPS的熒光光譜參數(shù)Table 2 Fluorescence spectral parameters of LB-EPS and TB-EPS at different salinities

Note:①Peak ratio;②Intensity

由表2可知，在LB-EPS中，相較于無(wú)鹽工況，峰A在鹽濃度為5、10、15 g·L-1工況下其發(fā)射波長(zhǎng)(Em)均發(fā)生5 nm紅移，激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)均發(fā)生5 nm藍(lán)移；峰B在鹽濃度為5 g·L-1時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)生5 nm藍(lán)移，在鹽濃度為10、15 g·L-1時(shí)其發(fā)射波長(zhǎng)均發(fā)生5 nm紅移，而激發(fā)波長(zhǎng)分別發(fā)生25 nm紅移(10 g·L-1)與5 nm紅移(15 g·L-1)。在TB-EPS中，相較于無(wú)鹽工況，峰A在鹽濃度為5、10、15 g·L-1時(shí)其發(fā)射波長(zhǎng)未產(chǎn)生移動(dòng)，但激發(fā)波長(zhǎng)分別發(fā)生15 nm紅移(5 g·L-1)與5 nm藍(lán)移(10、15 g·L-1)；峰B在鹽濃度為5、10、15 g·L-1時(shí)其發(fā)射波長(zhǎng)未產(chǎn)生移動(dòng)，但激發(fā)波長(zhǎng)分別發(fā)生15 nm紅移(5 g·L-1)與5 nm藍(lán)移(10、15 g·L-1)，其變化趨勢(shì)與峰A一致。研究表明，波長(zhǎng)移動(dòng)與EPS中各成分的結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)，其中波長(zhǎng)紅移與含羰基取代基、羥基、烷氧基、氨基和羧基含量增加相關(guān)聯(lián)，而波長(zhǎng)藍(lán)移則與芳香酯基減少，芳香環(huán)數(shù)下降，共軛鍵數(shù)的降低和羰基、羥基和氨基的減少直接相關(guān)[21]。熒光峰波長(zhǎng)及峰強(qiáng)度的變化說(shuō)明各層EPS中的組分構(gòu)成及組分結(jié)構(gòu)隨鹽濃度變化而發(fā)生改變。

2.5 鹽脅迫下分層EPS官能團(tuán)特性

為探究不同鹽濃度脅迫下LB-EPS和TB-EPS官能團(tuán)組成特性，分別對(duì)LB-EPS和TB-EPS樣品進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，結(jié)果如圖6。各鹽濃度下從波數(shù)3 462～613 cm-1共有6個(gè)主要的吸收峰，其波數(shù)分別為3 462～3 418 cm-1、2 382～2 380 cm-1、1 636～1 634 cm-1、1 414～1 410 cm-1、1 283～1 279 cm-1、644～613 cm-1。其中，3 462～3 418 cm-1處的吸收峰主要與多糖類化合物羥基和蛋白質(zhì)類物質(zhì)氨基的伸縮振動(dòng)有關(guān)[21]；2 382～2 380 cm-1處主要代表O=C=O的伸縮振動(dòng)；1 636～1 634 cm-1處的吸收峰是由蛋白質(zhì)酰胺I物質(zhì)引起，主要與蛋白質(zhì)酰胺I的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊中的C=O伸縮振動(dòng)密切相關(guān)[27]；1 414～1 410 cm-1處的吸收峰是由蛋白質(zhì)類物質(zhì)羧基中的C—O與COO鍵的伸縮振動(dòng)形成的[21]；1 283～1 279 cm-1附近的吸收峰是由蛋白質(zhì)酰胺 III 處 C—N 伸縮振動(dòng)引起的[27]；900～600 cm-1屬于指紋區(qū)，存在與氨基酸和核酸相關(guān)的振動(dòng)峰[27]，LB-EPS、TB-EPS紅外分析同樣表明，其中存在多種類型的蛋白質(zhì)及不同的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其官能團(tuán)主要為O—H、N—H、C=O、C—N。

圖6 不同鹽濃度下LB-EPS和TB-EPS的紅外光譜Fig.6 Infrared spectra of LB-EPS and TB-EPS under different salinities

隨鹽濃度由0 g·L-1提升至15 g·L-1，LB-EPS中3 452 cm-1波數(shù)處的吸收峰逐步偏移至3 418 cm-1，TB-EPS中相應(yīng)波數(shù)的吸收峰也發(fā)生了類似的偏移，其主要由多糖類化合物中的羥基和蛋白類物質(zhì)中的氨基引起，但具體主導(dǎo)物質(zhì)及官能團(tuán)尚無(wú)法確定，需進(jìn)一步分析研究。LB-EPS中，隨鹽濃度增加，波數(shù)為2 936 cm-1處的吸收峰逐漸消失，代表烷烴有機(jī)物和多糖分子中的C-H的伸縮振動(dòng)逐漸消失。在鹽濃度為15 g·L-1工況下，波數(shù)為1 283 cm-1的吸收強(qiáng)度明顯增加，表明LB-EPS中PN含量變化增加致使蛋白質(zhì)酰胺 III 處 C—N 伸縮振動(dòng)加強(qiáng)；同時(shí)此鹽濃度工況下，TB-EPS中明顯出現(xiàn)波數(shù)1 387 cm-1處的吸收峰，其是由甲基的伸縮振動(dòng)引起的，可能為高鹽脅迫下功能微生物在應(yīng)答過(guò)程中TB-EPS中物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度改變，形成含甲基官能團(tuán)類物質(zhì)。不同鹽濃度工況下，LB-EPS和TB-EPS的紅外光譜都發(fā)生了一定程度的變化，這表明鹽脅迫將影響LB-EPS和TB-EPS中的官能團(tuán)組成與數(shù)量。

3 結(jié)論

(2)鹽濃度提升引起ANAMMOX污泥中EPS含量及組成、EPS中蛋白質(zhì)含量與構(gòu)成、EPS中功能團(tuán)組成特性產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答，以抵御高鹽對(duì)功能微生物的不利影響，從而穩(wěn)定ANAMMOX工藝脫氮性能。