李 蕓，劉發(fā)龍，王巧晗,2??，劉 巖,2，李景玉,2，宮慶禮,2

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003)

自然環(huán)境中，微藻與細(xì)菌之間的相互作用非常復(fù)雜。以微藻為研究對(duì)象的正面作用中，藻際某些細(xì)菌可以通過提供營(yíng)養(yǎng)[1]、維生素[2]、植物激素[3]、螯合劑[4]、或揮發(fā)性有機(jī)化合物[5]，創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)環(huán)境[6]等方式來促進(jìn)微藻生長(zhǎng)；反面作用：細(xì)菌通過與微藻競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6]，產(chǎn)生毒素[7]，產(chǎn)生抑制微藻生長(zhǎng)的物質(zhì)[8]等方式抑制藻體生長(zhǎng)。此外，一些細(xì)菌雖然在培養(yǎng)前期可以促進(jìn)微藻生長(zhǎng)，但到培養(yǎng)后期最終會(huì)通過多種方式殺死它們的微藻宿主[9-11]。因此，細(xì)菌群落對(duì)提升或降低微藻的生產(chǎn)力有潛在作用。所以確定哪些細(xì)菌具有正面或負(fù)面影響，以及其在藻際細(xì)菌群落中是否占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位是非常重要的。假設(shè)可以將培養(yǎng)體系中細(xì)菌對(duì)微藻生長(zhǎng)的積極影響擴(kuò)大，消除細(xì)菌對(duì)微藻的消極影響，并且結(jié)合物理化學(xué)方法優(yōu)化微藻生物量生產(chǎn)，可能會(huì)大大提高微藻生產(chǎn)力，具有較強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)意義。

目前已有研究顯示巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)可以促進(jìn)小球藻(Chlorellavulgaris)的生長(zhǎng)[12]；根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)能促進(jìn)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、小球藻和布氏藻(Brucellabraunii)的生長(zhǎng)[13]等。目前關(guān)于雨生紅球藻藻際細(xì)菌的研究甚少，藻際細(xì)菌的研究大多集中在大型藻類(比如海帶及紫菜)、赤潮藻類[14-18]，以及一小部分餌料微藻[19-20]，所以關(guān)于雨生紅球藻藻際細(xì)菌多樣性及菌群結(jié)構(gòu)可查閱的文獻(xiàn)及研究進(jìn)展也非常有限；另外，混合營(yíng)養(yǎng)條件下的研究更是少之又少。其中張懷瑾[21]從自養(yǎng)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻際分離得到一株橘紅色的戈登氏菌株(Gordoniaterrae)，研究發(fā)現(xiàn)該菌株能夠合成胡蘿卜素，其提取物也有較強(qiáng)的抗氧化性，且耐高溫，推測(cè)其可能參與雨生紅球藻的蝦青素合成途徑，具有巨大的研究?jī)r(jià)值。探究雨生紅球藻藻際細(xì)菌多樣性，獲得對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的有益微生物，并且利用有益微生物來促進(jìn)雨生紅球藻綠色階段細(xì)胞數(shù)量的增加或者提高雨生紅球藻紅色階段的蝦青素積累量，對(duì)雨生紅球藻養(yǎng)殖具有巨大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)意義。本實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)分離法，利用細(xì)菌LB培養(yǎng)基分離了乙酸鈉兼養(yǎng)條件下雨生紅球藻藻際細(xì)菌，探究了雨生紅球藻藻際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，并利用16S rDNA測(cè)序方法對(duì)分離細(xì)菌鑒定；將篩選到的細(xì)菌液體培養(yǎng)，分別將細(xì)菌菌液按照一定的濃度與處于活躍期的藻種共培養(yǎng)，確定單一細(xì)菌對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)及蝦青素積累的影響。試圖利用藻際細(xì)菌來提高雨生紅球藻生物量生產(chǎn)或提高蝦青素含量。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)所使用的藻種為雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)，為中國(guó)海洋大學(xué)藻類學(xué)與藻類養(yǎng)殖研究實(shí)驗(yàn)室保存藻種。其長(zhǎng)期在本實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱中于錐形瓶培養(yǎng)；培養(yǎng)條件如下：

①綠色階段：培養(yǎng)溫度：23 ℃；光照強(qiáng)度:60 μmol·m-2·s-1；光暗周期：14 h∶10 h；光源：日光燈。

②紅色階段：培養(yǎng)溫度：26 ℃；光照強(qiáng)度:120 μmol·m-2·s-1；光暗周期：24 h∶0 h；光源：日光燈。實(shí)驗(yàn)所用雨生紅球藻培養(yǎng)基為MCM培養(yǎng)基[22]；pH調(diào)節(jié)為6.99～7.03。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

分離純化雨生紅球藻藻際細(xì)菌使用淡水LB培養(yǎng)基培養(yǎng)[23]；固、液態(tài)培養(yǎng)基分置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

1.3 試劑藥品

抗生素類：氯霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；有機(jī)溶劑及培養(yǎng)基藥品：甲醇、乙酸、二甲基亞砜、氫氧化鈉以及配制MCM培養(yǎng)液所需的試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；配制細(xì)菌通用培養(yǎng)基的試劑均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 雨生紅球藻藻際細(xì)菌的分離純化

將長(zhǎng)期在乙酸鈉混合營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種，按照1∶10 的比例接種于含有270 mL滅菌MCM培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)藻液實(shí)際濃度稀釋一定的倍數(shù)，分別吸取100 μL均勻涂布在提前倒好的無菌LB固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，待長(zhǎng)出菌落，及時(shí)挑取單菌落于新的LB固態(tài)培養(yǎng)基上，多次純化直至分離到純種菌落，且達(dá)到鑒定質(zhì)量。

2.2 細(xì)菌鑒定

2.2.1 試劑盒法提取細(xì)菌DNA 將純化好的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，8 000 r/min 離心5 min收集菌體。采用Bacterial DNA Kit試劑盒法提取各細(xì)菌DNA。

2.2.2 PCR擴(kuò)增 以提取的細(xì)菌DNA為模板，采用細(xì)菌16SrDNA序列通用引物27F(5′AGAGTTGATCCTGGCTCAG3)和1492R(5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳及菌株測(cè)序 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，利用瓊脂糖凝膠電泳，來檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物隨后交由北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。將公司測(cè)序返回的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST搜索。將鑒定出的細(xì)菌序列上傳至NCBI網(wǎng)站，并獲得登陸號(hào)。

2.3 純種雨生紅球藻的獲得

本實(shí)驗(yàn)中我們利用各抗菌譜抗生素聯(lián)合處理雨生紅球藻藻液，結(jié)合固態(tài)培養(yǎng)基純化獲得純種雨生紅球藻。通過查找常用抗生素抗菌譜，選擇的抗生素種類為：鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、氨芐青霉素。用超純水配制好10 g/L的抗生素母液，并采用抽濾方式除菌。4種抗生素同時(shí)分別添加(100～1 000 μg/mL；每100 μg/mL為一個(gè)梯度)處理雨生紅球藻藻液(共10個(gè)處理組，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù))。將擴(kuò)種的純種雨生紅球藻培養(yǎng)數(shù)代以消除抗生素影響后，以培養(yǎng)6 d、狀態(tài)較好的雨生紅球藻為藻種，收集離心并用滅菌培養(yǎng)液洗滌3次，重新懸浮在培養(yǎng)液中作為藻菌共培養(yǎng)的藻種。

2.4 細(xì)菌保種

接種純化好的單一菌株菌落，于裝有滅菌LB液體培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，搖床培養(yǎng)24 h后(T：28 ℃；轉(zhuǎn)速：180 r/min)；采用甘油與細(xì)菌菌液1∶1的比例保種于1.5 mL保種管中，并置于-80 ℃保存。

2.5 藻菌共培養(yǎng)菌種處理

分別取100 μL保種的菌液于裝有滅菌的LB液體培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中搖床培養(yǎng)24 h，用滅菌的50 mL離心管收集菌液并離心，去掉濾液，并用滅菌MCM培養(yǎng)液洗滌3次，重新用新鮮MCM培養(yǎng)液懸浮備用。

2.6 藻菌共培養(yǎng)

于含265 mL滅菌培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，分別加入30 mL重新懸浮的藻種，然后分別加入5 mL重新懸浮OD600值為0.50左右(接種濃度為104cfu/mL)的菌液。對(duì)照組不加懸浮菌液以5 mL滅菌MCM培養(yǎng)液代替，各處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。接種完成后，同時(shí)置于綠色階段培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)至第10天的雨生紅球藻轉(zhuǎn)移至紅色階段條件下培養(yǎng)，每天取樣在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞變紅情況。每天定點(diǎn)搖瓶3次，隨機(jī)交換錐形瓶位置，以避免藻細(xì)胞貼壁、沉降以及由于光照不均造成的誤差。

2.6.1 藻細(xì)胞密度的測(cè)定 在接種后第1天，每天取4 mL藻液于5 mL離心管中(取樣前要充分搖勻藻液，以免取樣不均所造成的誤差)，用滅菌的MCM培養(yǎng)液將藻液稀釋合適的倍數(shù)，取100 μL稀釋后的藻液于0.1 mL的浮游植物計(jì)數(shù)框中，在放大×100倍的光學(xué)顯微鏡下對(duì)藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，以減少計(jì)數(shù)過程中出現(xiàn)的誤差。

2.6.2 藻液pH測(cè)定 在接種后第1天，每天取4 mL藻液于5 mL離心管中(取樣前要充分搖勻藻液，以免取樣不均所造成的誤差)。利用Accumet.Fisher Scientific pH計(jì)測(cè)定藻液pH值。

2.6.3 葉綠素含量測(cè)定 每隔一天分別取4 mL藻液于10 mL離心管中離心，去除上清液。采用甲醇比色法測(cè)定[24]藻液葉綠素含量變化。

2.6.4 蝦青素含量測(cè)定 待鏡檢雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅后，分別取4.5 mL藻液于10 mL離心管中離心去上清液，綠色階段培養(yǎng)結(jié)束后，每天取樣顯微鏡下觀察藻細(xì)胞變紅情況。待對(duì)照組藻細(xì)胞完全變紅后，采用分光光度法測(cè)定藻液蝦青素含量[24]。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)表示為每個(gè)處理37個(gè)重復(fù)測(cè)量的代表性數(shù)值。通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差來檢查結(jié)果的可靠性。使用軟件IBM SPSS Statistics 22 單因素方差分析。通過方差分析(ANOVA)方法評(píng)估平均值的差異，確定數(shù)據(jù)是否符合方差齊性以及正態(tài)分布，結(jié)果差異顯著性進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)，使用excel軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 藻際細(xì)菌的分離與鑒定

在乙酸鈉兼養(yǎng)雨生紅球藻藻際中共分離到8株細(xì)菌，分別編號(hào)為DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH。分離到的細(xì)菌表觀特征如表1所示，照片如圖1所示。根據(jù)北京華大基因公司的測(cè)序結(jié)果，分別將8株細(xì)菌16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，編號(hào)為DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH的菌株分別于Pseudomonassp.,Methylobacteriumsp.、Chryseobacteriumsp.、Bacillussp.、Paracoccsusp.、Planctopirushydrillae、Rhodobactervinaykumarii、Brevundimonasvesicularis的16S rDNA序列具有最高的相似性。將8株細(xì)菌16S rDNA序列與其相近的細(xì)菌的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。將8株細(xì)菌16S rDNA的序列上傳至NCBI網(wǎng)站，獲得登陸號(hào)分別為MK675106、MK675107、MK675109、MK675110、MK675111、MK660006、MK660007、MK660008。

表1 藻際細(xì)菌表觀特征Table 1 The apparent characteristics of bacteria in the phycospherea

圖1 藻際細(xì)菌照片F(xiàn)ig.1 The picture of the bacterial in the phycospherea

3.2 抗生素處理雨生紅球藻

將不同濃度梯度的4種抗生素組合溶液與處于對(duì)數(shù)期兼養(yǎng)培養(yǎng)的雨生紅球藻一同接種于滅菌MCM培養(yǎng)液中處理培養(yǎng)3～5 d。每天搖瓶多次，以使抗生素與藻細(xì)胞充分接觸。處理結(jié)束，將用抗生素處理過的藻液接種于無菌的MCM培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～7 d，并利用添加乙酸鈉的MCM固態(tài)培養(yǎng)基來檢測(cè)除菌效果。最終在鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、氨芐青霉素分別為600 μg/mL的聯(lián)合抗生素組合處理?xiàng)l件下，獲得純種雨生紅球藻藻落。并將純種藻種逐級(jí)擴(kuò)種培養(yǎng)。

3.3 單一細(xì)菌的添加對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞密度的影響

如圖3所示。接種當(dāng)天即第0天的細(xì)胞密度不予測(cè)定，以避免藻細(xì)胞減少產(chǎn)生的不利影響。因XBL實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)過程中很早就出現(xiàn)細(xì)胞沉降，而且藻細(xì)胞聚集在一起被細(xì)菌菌膜包裹，計(jì)數(shù)時(shí)存在太大誤差，因此只統(tǒng)計(jì)了剩余7個(gè)處理組以及對(duì)照組的細(xì)胞密度變化情況。

由圖可以看出在綠色階段培養(yǎng)過程中，盡管藻細(xì)胞計(jì)數(shù)存在波動(dòng)，但隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而不斷上升。第1～5 d，藻細(xì)胞密度增加幅度較大；培養(yǎng)后期增長(zhǎng)較為緩慢；第9天大部分實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度達(dá)到最大，第10天有稍微下降的趨勢(shì)，原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，藻細(xì)胞貼壁的現(xiàn)象嚴(yán)重以及藻細(xì)胞出現(xiàn)沉降，導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)存在誤差。細(xì)胞密度由最初接種密度約為2.50×104cells/mL，在HS處理組的第9天獲得最高細(xì)胞密度，為3.65×105cells/mL。培養(yǎng)第1～7天，除DBQ、HB及FHS處理組外，其他各處理組均對(duì)藻細(xì)胞密度的增加表現(xiàn)出促進(jìn)作用；但在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)僅有HS、DBB 2個(gè)處理組中的藻細(xì)胞密度大于對(duì)照組(C)，且僅有HS處理組第9天細(xì)胞密度顯著高于對(duì)照組，其他處理組促進(jìn)效果并不顯著。DBQ處理組在10 d的培養(yǎng)過程中，密度顯著低于對(duì)照組以及其他處理組；其他處理組中藻細(xì)胞密度低于對(duì)照組，但與對(duì)照組差異并不顯著。在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)觀察到，處理組中藻細(xì)胞比較容易聚集在一起，不同于對(duì)照組大部分藻細(xì)胞都分散存在，也是處理組在計(jì)數(shù)時(shí)存在較大誤差的原因。

3.4 單一細(xì)菌對(duì)雨生紅球藻藻液pH的影響

圖4是各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)過程中藻液pH變化情況。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，培養(yǎng)體系pH為6.97～7.03。經(jīng)過10 d的培養(yǎng)，對(duì)照組pH最高達(dá)到9.36左右，其他處理組也都達(dá)到9.00左右的高pH。培養(yǎng)前期pH上升幅度較大，該時(shí)間段也對(duì)應(yīng)了藻細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，所以通過pH的變化情況也可以從側(cè)面反映雨生紅球藻的生長(zhǎng)分裂能力。第7～10天，pH變化幅度較小，甚至有下降的趨勢(shì)，其也對(duì)應(yīng)了實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞密度增加緩慢的現(xiàn)象，說明雨生紅球藻已進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。而且各實(shí)驗(yàn)組的pH除在第3～5天有顯著差異外，其余時(shí)間pH差異不顯著，特別是在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)。因總培養(yǎng)體積有限所導(dǎo)致的取樣體積有限是導(dǎo)致pH測(cè)定過程中誤差較大的原因，另外實(shí)驗(yàn)操作中也存在一定誤差。

3.5 單一細(xì)菌對(duì)雨生紅球藻葉綠素含量的影響

圖5是各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)過程中藻液葉綠素含量變化情況。因培養(yǎng)初期藻細(xì)胞密度較低，所以從接種后的第3天開始每隔1 d取樣測(cè)定，到培養(yǎng)后期每天取樣測(cè)定葉綠素含量。由圖可以看出在培養(yǎng)期間的藻液葉綠素含量變化與藻細(xì)胞密度有一定的相似性。第3天，各實(shí)驗(yàn)組的葉綠素含量無顯著差異。第6～8天，除HB、DBQ、XBL處理組外其余各處理組中的葉綠素含量均大于對(duì)照組，但與對(duì)照組并無顯著差異。第3～8天，各實(shí)驗(yàn)組葉綠素含量都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在這段時(shí)期，細(xì)胞密度增加是導(dǎo)致葉綠素含量上升的主要因素；第8～10天，除對(duì)照組、DBQ處理組外，其他實(shí)驗(yàn)組都呈現(xiàn)不變及下降的趨勢(shì)。另外，第9～10天，添加菌液的處理組葉綠素含量降低幅度普遍高于對(duì)照組。在藻液葉綠素測(cè)定過程中，因培養(yǎng)總體積不大，導(dǎo)致每天進(jìn)行葉綠素測(cè)定時(shí)取樣體積較小，及添加菌液的處理組在培養(yǎng)中后期藻細(xì)胞聚集在一起，導(dǎo)致取樣不均勻都是導(dǎo)致藻液葉綠素含量測(cè)定時(shí)出現(xiàn)較大誤差的原因。

圖2 8株藻際細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of 8 strains of bacteria in the phycosphere

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖3 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞密度
Fig.3 The cell density ofHaematococcuspluvialisin co-culture of algae and bacteria

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖4 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻藻液pH
Fig.4 The pH value ofHaematococcuspluvialisin co-culture of algae and bacteria

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖5 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻藻液葉綠素含量
Fig.5 The chlorophyll content ofHaematococcuspluvialisin co-culture of algae and bacteria

3.6 單一細(xì)菌對(duì)雨生紅球藻蝦青素積累的影響

圖6是單一細(xì)菌對(duì)雨生紅球藻藻液及單個(gè)藻細(xì)胞蝦青素含量的影響。雨生紅球藻經(jīng)過綠色階段的培養(yǎng)，藻細(xì)胞增加到一定數(shù)目，通過改變培養(yǎng)條件，以加快藻細(xì)胞中蝦青素的積累速率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)藻細(xì)胞密度增加有一定促進(jìn)作用的處理組中，僅有HS處理組略高于對(duì)照組，但差異并不顯著，蝦青素含量分別為44.35和43.84 mg/L。其他處理組藻液蝦青素含量或顯著低于對(duì)照組或與對(duì)照組無顯著差異。DBQ處理組雖細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照組，但該處理組藻液蝦青素含量與對(duì)照組并無顯著差異。通過計(jì)算單個(gè)藻細(xì)胞蝦青素含量，發(fā)現(xiàn)DBQ處理組單個(gè)藻細(xì)胞蝦青素含量顯著高于對(duì)照組及其他處理組，因此DBQ菌液的添加的雖然不會(huì)促進(jìn)藻細(xì)胞密度的增加，但是對(duì)于單個(gè)藻細(xì)胞蝦青素積累來說有一定的優(yōu)勢(shì)。其他處理組單個(gè)細(xì)胞蝦青素含量顯著低于對(duì)照組或與對(duì)照組無顯著差異。

4 討論

現(xiàn)階段由于培養(yǎng)條件的限制，大多數(shù)異養(yǎng)細(xì)菌不能人為培養(yǎng)。有研究表明，我們僅能培養(yǎng)自然環(huán)境中占比不到1%的微生物[25-26]。但在本實(shí)驗(yàn)中利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得了8株藻際細(xì)菌，不僅探究了乙酸鈉兼養(yǎng)下雨生紅球藻藻際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，也為探究其對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)和蝦青素積累的影響提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。從藻際細(xì)菌種類來看，乙酸鈉兼養(yǎng)條件下的藻際可培養(yǎng)細(xì)菌種類豐富，相比張懷瑾在自養(yǎng)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻際分離到1株藻際細(xì)菌的結(jié)果[21]，本實(shí)驗(yàn)中乙酸鈉的添加是分離到藻際細(xì)菌種類較多的最大原因。乙酸鈉的添加不僅為藻細(xì)胞提供了異養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)的碳源，同時(shí)也為藻際細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供了營(yíng)養(yǎng)。分離到的藻際細(xì)菌以變形菌門(Proteobacteria)為主，該菌門也在很多海洋微藻藻際被分離到[17,27-29]，雖然雨生紅球藻為淡水微藻，其與海水細(xì)菌種類同源性還是較大的。另外，分離過程中擬桿菌門(Bacteroidetes)的Chryseobacteriumsp.是優(yōu)勢(shì)菌株，該菌株也是在自然環(huán)境中分離比較頻繁的細(xì)菌種類[30-31]。另外，有許多研究表明Paracoccussp.、Pseudomonassp.中的某些菌株具有降解有機(jī)污染物的能力[32-34]。

目前來說，獲得純種微藻的方法有很多。利用單一的除菌方法往往效果不佳，局限性較大，導(dǎo)致純化效率不高。本實(shí)驗(yàn)中我們結(jié)合韓吉昌等[35]提供的無菌微藻獲得方法，采用應(yīng)用廣泛的抗生素處理法結(jié)合平板劃線法來獲得純種藻株。在藻菌共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有2株菌株(DBB、HS)對(duì)藻細(xì)胞密度增加有促進(jìn)作用，其分別屬于厚壁菌門(Bacteroidetes)、變形菌門。對(duì)于有些細(xì)菌在培養(yǎng)前期促進(jìn)藻細(xì)胞密度增加，而在培養(yǎng)后期抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)的現(xiàn)象，很可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)前期各營(yíng)養(yǎng)元素較為充足，并且異養(yǎng)細(xì)菌與藻細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)方式有一定的互補(bǔ)作用，因此會(huì)加快藻細(xì)胞密度增加；而到培養(yǎng)中后期，由于各營(yíng)養(yǎng)元素消耗殆盡，細(xì)菌很可能會(huì)與藻細(xì)胞爭(zhēng)奪微量元素或者其他物質(zhì)，因此會(huì)出現(xiàn)抑制作用；另一方面，因?yàn)榉蛛x的細(xì)菌菌株大部分會(huì)積累色素，隨著體系中細(xì)菌密度的增加，很可能對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生遮光作用，會(huì)影響藻細(xì)胞對(duì)光能的利用效率；最后體系中細(xì)菌的大量繁殖，會(huì)產(chǎn)生菌膜，對(duì)藻細(xì)胞的自由運(yùn)動(dòng)以及分裂產(chǎn)生阻礙作用，會(huì)加速藻細(xì)胞老化。另外，培養(yǎng)后期較高的pH值也許是限制雨生紅球藻細(xì)胞密度增加的另一個(gè)因素。

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖6 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻藻液及單個(gè)細(xì)胞年蝦青素含量
Fig.6 The astaxanthin content ofHaematococcuspluvialisliquid and single cell in co-culture of algae and bacteria

綠色階段10天培養(yǎng)過程中pH上升幅度較大，一方面說明雨生紅球藻對(duì)培養(yǎng)體系中pH的緩沖作用較差，同時(shí)說明藻細(xì)胞對(duì)堿性培養(yǎng)環(huán)境的耐受度較高。王璇等人的研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過程中藻液pH的變化與營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的變化存在一定的相關(guān)性[36]，另外在該研究中在綠色階段第 7 天后，pH 的升高放緩的現(xiàn)象[36]與本研究結(jié)果較為相似。各實(shí)驗(yàn)組pH在接種后1～5 d顯著增加，這可以通過硝酸鹽代謝來解釋[37]：雨生紅球藻細(xì)胞的不斷生長(zhǎng)繁殖使得MCM培養(yǎng)液中的硝酸鹽被轉(zhuǎn)移到雨生紅球藻細(xì)胞中，其中硝酸鹽通過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶催化的兩個(gè)還原反應(yīng)被還原成銨；同時(shí)，在這些還原反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生OH-和H2O，由硝酸鹽轉(zhuǎn)化為銨產(chǎn)生的OH-將釋放到培養(yǎng)基中，是導(dǎo)致pH升高的重要原因。也有研究顯示外源碳乙酸鈉的添加也是導(dǎo)致藻液pH較高的原因，但Pang等[38]的實(shí)驗(yàn)中，添加1.33 g/L乙酸鈉培養(yǎng)的雨生紅球藻藻液在培養(yǎng)結(jié)束后穩(wěn)定在8.50左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)9.30的pH。猜測(cè)，藻株及其他培養(yǎng)條件存在差異是出現(xiàn)巨大差異的原因。綠色階段后期藻液中CO2溶解度增加是藻液pH有下降趨勢(shì)的原因，因培養(yǎng)后期，藻液中營(yíng)養(yǎng)元素已經(jīng)消耗殆盡，藻細(xì)胞光合作用強(qiáng)度下降，導(dǎo)致藻液中CO2濃度升高，其次菌液的添加使得處理組細(xì)菌可能會(huì)大量繁殖，也會(huì)產(chǎn)生一部分CO2使得藻液CO2溶解度增加。

處于綠色階段的雨生紅球藻細(xì)胞中主要色素組成為葉綠素、β-胡蘿卜素、葉黃素；紅色階段雨生紅球藻細(xì)胞中蝦青素含量會(huì)大幅度上升，還會(huì)出現(xiàn)角黃素以及海膽酮等次生胡蘿卜素[39-42]。藻液葉綠素含量的變化趨勢(shì)大體符合細(xì)胞密度變化趨勢(shì)，說明藻液葉綠素濃度在一定程度上可以反映藻細(xì)胞密度及細(xì)胞活力。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)第8天后，各實(shí)驗(yàn)組中葉綠素濃度的停滯及下降預(yù)示著藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到脅迫，比如培養(yǎng)體系中pH過高、營(yíng)養(yǎng)元素消耗殆盡等，使得藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素向其他色素轉(zhuǎn)變，蝦青素開始積累。對(duì)于有些處理組中葉綠素含量降低幅度高于對(duì)照組的現(xiàn)象，一定程度上說明藻際細(xì)菌的添加會(huì)加快藻細(xì)胞由綠色階段向紅色階段的轉(zhuǎn)變速率，即藻際細(xì)菌的添加可能會(huì)抑制藻細(xì)胞的活力。如林偉等[43]發(fā)現(xiàn)，除菌后的球等鞭金藻及小球藻不易老化，更容易保持懸浮狀態(tài)；回加細(xì)菌于除菌藻，藻細(xì)胞容易下沉附底。

大量研究顯示雨生紅球藻在脅迫條件下，例如高溫、高光照、營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏等條件，細(xì)胞內(nèi)會(huì)大量積累蝦青素[44]。對(duì)藻細(xì)胞密度增加有一定促進(jìn)作用的 HS、DBB處理組，并不能顯著提高藻液蝦青素含量。對(duì)藻細(xì)胞密度增加有顯著抑制作用的DBQ處理組反而能顯著提高單個(gè)藻細(xì)胞蝦青素含量，DBQ處理組中單位藻細(xì)胞蝦青素含量較高的原因是復(fù)雜的，尤其細(xì)菌的存在會(huì)使得培養(yǎng)液的組分及其物質(zhì)循環(huán)變得更加復(fù)雜[45]。本實(shí)驗(yàn)中DBQ處理組顯著抑制雨生紅球藻生長(zhǎng)所造成的脅迫環(huán)境對(duì)藻細(xì)胞蝦青素積累是有利的，推測(cè)原因可能是DBQ的添加促進(jìn)了藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素合成途徑[46]，比如DBQ有可能會(huì)產(chǎn)生合成蝦青素的前體物質(zhì)[46]，或者促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)中酶活性加快蝦青素積累[48]，導(dǎo)致單位細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也充分說明想要提高雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量，綠色階段生物量的積累和紅色階段單位藻細(xì)胞的蝦青素積累效率都是必要的。因此可以考慮在雨生紅球藻綠色階段結(jié)束后，添加DBQ菌株的菌液，以達(dá)到促進(jìn)單個(gè)藻細(xì)胞中蝦青素積累的效果。

5 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)在乙酸鈉混合營(yíng)養(yǎng)條件下，分離了8株雨生紅球藻藻際細(xì)菌。經(jīng)過16S rDNA鑒定發(fā)現(xiàn)其分別屬于Pseudomonassp.、Methylobacteriumsp.、Chryseobacteriumsp.、Bacillussp.、Paracoccussp.、Planctopirushydrillae、Rhodobactervinaykumarii、Brevundimonasvesicularis。在單一細(xì)菌與雨生紅球藻共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在，發(fā)現(xiàn)Methylobacteriumsp.、Bacillussp.能夠促進(jìn)綠色階段雨生紅球藻藻細(xì)胞密度的增加，Pseudomonassp.對(duì)于增加單位細(xì)胞蝦青素含量具有一定優(yōu)勢(shì)。