于海潮，張洪海,2,3，高旭旭，楊桂朋,2,3??

(1.中國海洋大學化學化工學院，山東 青島 266100；2.海洋國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266237；3.中國海洋大學海洋化學研究所，山東 青島 266100)

自工業(yè)革命以來，人類工業(yè)迅速發(fā)展，對化石能源的大量使用使大氣中CO2濃度從工業(yè)革命前的0.028 kPa增加至0.04 kPa[1]。CO2作為重要溫室氣體，能大量吸收地面反射的紅外線，引起全球溫度的升高。作為大氣CO2最大的匯之一，目前海水表層pH已降低了0.1個單位，并有繼續(xù)降低的趨勢[2]。全球變暖和海洋酸化問題日益嚴重。而在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，浮游植物貢獻了絕大部分初級生產(chǎn)力，為全球的物質(zhì)循環(huán)和能量流動提供了基礎(chǔ)，其生長繁殖既受氣候影響，又對全球氣候調(diào)節(jié)有著重要作用[3-4]。全球變暖和海洋酸化將導致浮游植物生存環(huán)境的改變，其影響不容忽視。

二甲巰基丙酸內(nèi)鹽(DMSP)是DMS的主要前體物質(zhì)，一般以顆粒態(tài)(Particulate DMSP,DMSPp)和溶解態(tài)(Dissolved DMSP,DMSPd)兩種形式存在，主要來自海洋浮游植物的釋放[12]。DMSP是海洋中DMS的主要來源，可以在浮游植物細胞內(nèi)經(jīng)裂解酶產(chǎn)生DMS，或在釋放到海水中之后在細菌等微生物的作用下產(chǎn)生DMS。DMSP有調(diào)節(jié)藻類細胞內(nèi)滲透壓的作用，對環(huán)境相對敏感，受鹽度、溫度、光照、營養(yǎng)鹽等多種因素影響[13]。DMSP的濃度分布及轉(zhuǎn)化情況對DMS有著直接影響，進而影響著全球氣候變化。

早期的海洋酸化研究中，對象主要集中在鈣化藻類，如大洋橋石藻(Gephyrocapsaoceanica)和赫氏圓石藻(Emilianiahuxleyi)[14]，顆石藻(Emiliania.huxleyi)[15]等。隨著對海洋酸化的進一步研究，硅藻作為浮游植物的重要組成逐漸受到重視。本文選擇的旋鏈角毛藻隸屬于角毛藻屬，是一種小型的海洋浮游硅藻，細胞小而壁薄，多為單個生活，廣泛分布于我國東海、黃海、渤海等區(qū)域，是膠州灣夏季的主要優(yōu)勢藻種，曾多次引發(fā)赤潮[16]。目前國內(nèi)對旋鏈角毛藻的研究較為有限，多集中于溫度、光照等單因素影響下的生長情況變化[17]，及對自然環(huán)境下旋鏈角毛藻的二甲基硫化物釋放量進行研究[18]等。因此本文選擇在pH和溫度兩種實驗條件下同時檢測旋鏈角毛藻生物量的變化情況和二甲基硫化物的釋放情況，通過研究不同pH和不同溫度的交互影響下旋鏈角毛藻的生物量及釋放二甲基硫化物的變化，為進一步解釋全球氣候變暖、海洋酸化對旋鏈角毛藻的生長及釋放二甲基硫化物的影響提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻類培養(yǎng)

實驗所用旋鏈角毛藻取自中國海洋大學海洋污染生態(tài)化學實驗室微藻培養(yǎng)室。實驗用海水采用中國東海海水，經(jīng)0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾，121 ℃滅菌20 min后使用。

實驗使用500 mL膠塞封口瓶進行無頂空、半連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液采用f/2營養(yǎng)配方(所有成分均經(jīng)過高溫滅菌處理)。按培養(yǎng)液體積1∶20的比例定量接入指數(shù)生長期的旋鏈角毛藻后，將封口瓶置于光照培養(yǎng)箱(光暗周期12 h∶12 h，光照強度4 000 lx，光源為白色冷熒光燈管)中連續(xù)培養(yǎng)。

培養(yǎng)期間需每天3次震蕩樣品瓶，以防藻類沉淀，保證藻類生長狀態(tài)良好及溶解氣體保持穩(wěn)定。每隔一天上午9:00進行取樣，取樣后加飽和CO2培養(yǎng)液調(diào)節(jié)pH至設(shè)定值，然后補充相應pH的適量培養(yǎng)液以保持無頂空狀態(tài)。

1.2 實驗設(shè)置

根據(jù)茅華等[17]的研究結(jié)果，旋鏈角毛藻的最佳生長環(huán)境是：溫度為20 ℃，pH為8.1。結(jié)合全球變暖情況及全球海洋環(huán)境變化趨勢[19-20]，本文設(shè)定了較高溫度和較低pH值環(huán)境與旋鏈角毛藻最佳生長環(huán)境相比較，分別設(shè)定：2個溫度(20、25 ℃)和2個pH(7.8、8.1)。每組實驗設(shè)定3個平行樣。前期培養(yǎng)旋鏈角毛藻藻種至指數(shù)生長期后接入樣品瓶，連續(xù)培養(yǎng)16天，期間保持pH穩(wěn)定(±0.08)的無頂空狀態(tài)。培養(yǎng)期間隔天取樣，分別測定旋鏈角毛藻的生物量、培養(yǎng)液中DMS、DMSP總量(DMSPt)和DMSPd含量。使用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性分析。

1.3 樣品分析方法

1.3.1 藻細胞密度和比生長率的測定 取4 mL藻液，加入魯格試劑將藻細胞進行固定，用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下進行計數(shù)。每個樣品計數(shù)三次，取其平均值。藻密度計算公式為：

X=A/4×10 000。

(1)

式中:X為藻密度，單位為cell·mL-1；A為顯微鏡下所計數(shù)量平均值。

比生長率計算公式為：

μ=(lnCn-lnC0)/(Tn-T0)。

(2)

式中:μ代表比生長率；Cn、C0分別代表第n天、第0天的細胞密度；Tn、T0分別代表培養(yǎng)第n天、第0天。

1.3.2 培養(yǎng)液中DMS的測定 采用冷阱吹掃-捕集氣相色譜法進行DMS樣品測定[21-22]。用5 mL玻璃注射器精確取得2 mL海水樣品于干燥的10 mL西林瓶中，用高純N2吹掃樣品，使樣品中的DMS通過Nafion管除水。干燥后的氣體經(jīng)六通閥進入1/16 Teflon捕集管，對DMS進行富集濃縮，吹掃3 min后，將捕集管迅速放入熱水(90 ℃)中進行解析，DMS隨載氣進入氣相色譜儀(島津GC-2014)，由火焰光度檢測器(FPD)進行檢測。使用本方法測定的DMS檢出限為0.2 nmol·L-1，相對標準偏差(RSD)小于5%[23]。

1.3.3 培養(yǎng)液中DMSP的測定 由于在強堿(pH≥ 13)條件下，DMSP可以1∶1完全降解為DMS[24]，所以往往測定DMS間接獲得DMSP的含量，另外，用DMSPt減去DMSPd的濃度即可得DMSPp的濃度。DMSPt測定過程為：取4 mL培養(yǎng)液，加入40 μL 的50%H2SO4溶液去除培養(yǎng)液中的DMS，然后從中取2 mL培養(yǎng)液樣品，加入200 μL的10 mol·L-1KOH溶液，密封后在4 ℃條件下避光靜置大于24 h以確保DMSP能夠完全轉(zhuǎn)化為DMS。DMSPd測定時需先用Whatman GF/F 玻璃纖維濾膜進行重力過濾，取4 mL濾液，其他過程同上。24 h后按照DMS分析方法進行測量，得到的即為DMSP的含量[25]。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同pH、溫度下旋鏈角毛藻藻密度的變化情況

4組實驗條件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋鏈角毛藻的藻細胞密度變化如圖1所示。四種條件下的旋鏈角毛藻生長趨勢都基本呈現(xiàn)S型曲線，符合藻類一次性培養(yǎng)的生長規(guī)律。

圖1 培養(yǎng)液中旋鏈角毛藻藻密度變化Fig.1 Changes in the density of Chaetoceros curvisetusin the culture

pH=7.8時，20 ℃條件下旋鏈角毛藻在培養(yǎng)第1～7天迅速生長，在第7天達到峰值(19.675×105cell·mL-1)，第9～16天基本保持穩(wěn)定生長；25 ℃條件下旋鏈角毛藻在培養(yǎng)第3～9天迅速生長，在第9天達到峰值(16.15×105cell·mL-1)，第11～16天進入衰亡期，藻細胞數(shù)略有下降。pH=8.1時，20 ℃、25 ℃條件下的旋鏈角毛藻生長趨勢基本同上，20 ℃時在第7天達到峰值(21.3×105cell·mL-1)，25 ℃在第9天達到峰值(16.8×105cell·mL-1)。

溫度為20 ℃時，兩種pH條件下的旋鏈角毛藻生長趨勢基本一致，都是在第1～7天迅速生長，第7～9天略有下降，第9～16天基本保持穩(wěn)定。其中，pH為8.1時藻密度要略大于pH為7.8時。溫度為25 ℃時，兩種pH條件下的旋鏈角毛藻生長趨勢也基本保持一致，峰值均出現(xiàn)在第9天時。其中，pH為7.8時前期藻密度較大，但在第9天達到峰值時，pH為8.1時藻密度略大于pH為7.8時，整體差異不大。

2.2 不同pH、溫度下旋鏈角毛藻比生長率的變化情況

4組實驗條件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋鏈角毛藻比生長率變化如圖2所示。四種條件下的比生長率分別在第3、5、5和5 d達到最大值，分別為0.59、0.50、0.50和0.41 d-1。4組曲線整體上均呈現(xiàn)先快速增長后緩慢降低的趨勢。

20 ℃條件下，pH=7.8時比生長率在第1～3天快速增長，并在第3～7天保持較高值，pH=8.1時比生長率在第1～5天快速增長，并在第5～7天保持較高值；25 ℃條件下，pH=7.8時比生長率在第1～3天幾乎無變化，在第3～5天快速增長至峰值，pH=8.1時比生長率在第1～5天逐漸增長，并在第5～7天保持相對穩(wěn)定。四種條件下的比生長率在第7～16天期間均呈逐漸減小的趨勢，數(shù)值上差異不大。

圖2 培養(yǎng)液中旋鏈角毛藻比生長率變化Fig.2 Changes in specific growth rate of Chaetoceros curvisetusin the culture

2.3 不同pH、溫度下旋鏈角毛藻單細胞釋放DMS的變化情況

4組實驗條件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋鏈角毛藻培養(yǎng)過程中單細胞DMS濃度變化如圖3所示。單細胞DMS濃度變化范圍分別為(0.92～45.36)(13.96)×10-9，(2.10～27.12)(9.27)×10-9，(1.91～19.62)(14.32)×10-9，(1.45～34.57)(11.07)×10-9nmol·cell-1。在不同pH、溫度條件下，單細胞DMS濃度變化曲線基本一致，均符合先增大后減小的整體趨勢。

圖3 pH、溫度變化對旋鏈角毛藻單細胞DMS含量的影響Fig.3 Effects of pH and temperature on DMS content in single cell of Chaetoceros curvisetus

溫度為20 ℃時，兩種pH條件下DMS濃度變化趨勢基本一致：第1～7天小范圍浮動，第7～9天迅速增長至最大值，第9～16天逐漸減少；其中，pH為8.1時DMS濃度略大于pH為7.8時。溫度為25 ℃時，兩種pH條件下DMS濃度變化趨勢基本一致：第1～7天基本保持穩(wěn)定，濃度變化很小，第7～11天迅速增長至最大值，第11～16天逐漸減少；前期兩種pH條件下DMS濃度基本相同，第7天之后pH為8.1時DMS濃度略大于pH為7.8時。

如圖3所示，溫度從20 ℃升高到25 ℃時，DMS濃度峰值的出現(xiàn)從第9天推移到第11天，最大值也從47.41 nmol·cell-1(pH=7.8)和54.83 nmol·cell-1(pH=8.1)，下降到27.94 nmol·cell-1(pH=7.8)和39.50 nmol·cell-1(pH=8.1)。而溫度不變時，改變pH，DMS濃度的整體變化趨勢基本不變，數(shù)值隨pH降低而略有減小。

2.4 不同pH、溫度下旋鏈角毛藻單細胞DMSP含量的變化情況

4組實驗條件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋鏈角毛藻培養(yǎng)過程中單細胞DMSPt、DMSPd濃度變化分別如圖4和圖5所示。其中，單細胞DMSPt濃度變化范圍分別為(1.18～52.00)(13.89)×10-8，(5.29～13.96)(9.88)×10-8，(2.87～62.94)(14.28)×10-8，(4.31～22.72)(9.99)×10-8nmol·cell-1。單細胞DMSPd濃度變化范圍分別為(0.34～9.82)(2.86)×10-8，(0.81～3.20)(2.05)×10-8，(0.74～12.10)(3.31)×10-8，(2.29～14.76)(6.99)×10-8nmol·cell-1。

圖4 pH、溫度對旋鏈角毛藻單細胞DMSPt含量的影響Fig.4 Effects of pH and temperature on DMSPt content in single cell of Chaetoceros curvisetus

比較實驗中，DMSPt、DMSPd的變化趨勢高度一致，基本都符合先增加后減少的趨勢：在第1～7天基本保持穩(wěn)定，DMSP濃度小范圍浮動，第7～9天迅速增長至最大值，第9～16天逐漸減少。峰值按pH=8.1，20 ℃、pH=7.8，20 ℃、pH=8.1，25 ℃、pH=7.8，25 ℃依次遞減。

圖5 pH、溫度對旋鏈角毛藻單細胞DMSPd含量的影響Fig.5 Effects of pH and temperature on DMSPd content in single cell of Chaetoceros curvisetus

2.5 旋鏈角毛藻藻密度與釋放DMSP總量

分別以20 ℃，pH=8.1；25 ℃，pH=7.8為例，分析旋鏈角毛藻藻密度變化與釋放DMSP總量的關(guān)系，變化曲線如圖6、7。

圖6 20 ℃，pH=8.1時，旋鏈角毛藻藻密度與培養(yǎng)液中DMSP總濃度變化Fig.6 Changes in the density and the total concentration of DMSP in the culture of Chaetoceros curvisetus at 20 ℃ and pH=8.1

圖7 25 ℃，pH=7.8時，旋鏈角毛藻藻密度與培養(yǎng)液中DMSP總濃度變化Fig.7 Changes in the density and the total concentration of DMSP in the culture of Chaetoceros curvisetus at 25 ℃ and pH=7.8

20 ℃，pH=8.1時，前期旋鏈角毛藻藻密度持續(xù)增長，DMSP總含量基本保持不變；第7～9天時藻密度下降，DMSP總濃度迅速增大至最大值；第9～16天藻密度變化小幅度波動，DMSP濃度在第11天時迅速減小，在第11～16天期間保持小范圍的變化。25 ℃，pH=7.8時，DMSP濃度變化總體幅度較小，DMSP濃度與藻密度變化趨勢基本與20 ℃，pH=8.1時保持一致，同樣是在藻密度迅速下降時DMSP濃度猛增至峰值。25與20 ℃條件下，指數(shù)生長期中的藻密度與DMSP釋放量均存在較明顯變化(P<0.05)。

2.6 旋鏈角毛藻藻密度與釋放DMS總量的比較

分別以20 ℃，pH=8.1；25 ℃，pH=7.8為例，分析旋鏈角毛藻藻密度變化與釋放DMS總量的關(guān)系，變化曲線如圖8、9。

圖8 20 ℃，pH=8.1時，旋鏈角毛藻藻密度與培養(yǎng)液中DMS總濃度變化Fig.8 Changes in the density and the total concentration of DMS in the culture of Chaetoceros curvisetusat 20 ℃ and pH=8.1

圖9 25 ℃，pH=7.8時，旋鏈角毛藻藻密度與培養(yǎng)液中DMS總濃度變化Fig.9 Changes in the density and the total concentration of DMS in the culture of Chaetoceros curvisetusat 25℃ and pH=7.8

20 ℃，pH=8.1時，前期旋鏈角毛藻藻密度持續(xù)增長，DMS總含量無明顯變化；第7～9天時藻密度下降，DMS總濃度迅速增大至最大值；第9～16天藻密度變化小幅度波動，DMS濃度也隨之有小范圍的變化。25 ℃，pH=7.8時，DMS濃度與藻密度變化趨勢基本與20 ℃，pH=8.1時保持一致，不同的是藻密度峰值延遲至第9天出現(xiàn)，而DMS濃度的峰值也隨之延遲到了第11天，同樣是在藻密度迅速下降時DMS濃度猛增至峰值。不同溫度條件下，指數(shù)生長期中的藻密度與DMS釋放量均存在較明顯變化(P<0.05)。

3 分析與討論

pH、溫度變化實驗結(jié)果表明，旋鏈角毛藻較其他藻類而言對pH變化相對敏感，藻密度和生長比率均隨pH降低而有所下降，但溫度因素對旋鏈角毛藻生長的影響程度要遠大于pH因素[26]。由旋鏈角毛藻藻密度變化曲線(見圖1)可以看出旋鏈角毛藻在20～25 ℃，pH為7.8～8.1條件下均能存活，但pH=8.1，20 ℃條件下更適合于旋鏈角毛藻的生長，全球變暖、海洋酸化等問題帶來的溫度升高，pH降低等變化將會一定程度上抑制旋鏈角毛藻的生長。茅華等[17]通過對旋鏈角毛藻在不同溫度、pH條件下培養(yǎng)研究得出的最佳生長條件：溫度為20℃，光照為78.12 μE·m-2·s-1，鹽度為25，pH為8.3。這與本文結(jié)果基本一致。

與此同時，在實驗條件范圍內(nèi)，pH變化對旋鏈角毛藻釋放DMS的量影響不大，溫度變化卻對旋鏈角毛藻釋放DMS量有著重要影響。這與溫度是旋鏈角毛藻生物量變化的重要影響因素相呼應，進一步證明了浮游植物是DMS的重要來源。目前國際上對于海洋酸化對二甲基硫化物的釋放是否存在影響、存在著怎樣的影響并沒有得出統(tǒng)一的答案，如Vogt等[27]發(fā)現(xiàn)，低pH(CO2濃度為：(700～1 050)×10-6)和高pH(CO2濃度為：350×10-6)條件下，DMS和DMSPd濃度并沒有顯著差異。而Hopkins等[28]研究發(fā)現(xiàn)，低pH(CO2濃度為：750×10-6)與高pH(CO2濃度為：380×10-6)條件相比，DMS和DMSPd濃度顯著降低。不同的結(jié)果可能是由于實驗方法的差異，而本文得出的結(jié)論與Vogt等基本一致。本文所研究的旋鏈角毛藻雖然不是DMS高產(chǎn)藻種，但在如東海等海域作為優(yōu)勢藻種在數(shù)量上有著巨大優(yōu)勢，對DMS的釋放依然有著不可忽視的重要作用。

培養(yǎng)液中的DMS由DMSP降解而產(chǎn)生，因此DMSP含量變化與DMS含量緊密相關(guān)。DMSP降解的主要途徑有兩種：一是在載體和酶的作用下，DMSP去甲基化生成甲硫醇和丙烯酸鹽，二是在DMSP裂解酶作用下，DMSP裂解產(chǎn)生DMS和丙烯酸鹽。其中，第二種途徑是DMS的主要來源[29-30]。4組實驗中，單細胞中DMS與DMSP的濃度變化趨勢基本保持同步，但在25 ℃條件下，單細胞DMS含量的峰值較20℃時略有延遲；pH變化對二者變化趨勢及峰值均無明顯影響。由此表明，DMSP裂解產(chǎn)生DMS的過程主要受溫度變化影響，在20～25 ℃范圍內(nèi)與溫度呈負相關(guān)，而pH變化對DMSP裂解過程影響不大。

由圖8和9可以看出，DMS濃度迅速增長均出現(xiàn)于藻密度迅速減小時，pH、溫度的變化僅在一定程度上延遲了峰值的出現(xiàn)，但并未改變DMS峰值出現(xiàn)于藻類生長衰亡期這一相關(guān)關(guān)系。DMS雖然可以由浮游植物直接釋放，但主要還是來源于DMSP的降解。浮游植物細胞生長期間可以自然分泌少量DMSP至培養(yǎng)液中，或在被浮游動物吞噬、病毒入侵或細胞自然衰老等情況下造成植物細胞破裂，大量DMSP直接進入培養(yǎng)液中，降解生成大量DMS[31～32]。因此在微藻培養(yǎng)實驗中，DMS的峰值多出現(xiàn)在藻類生長的衰亡期[18,33]。

4 結(jié)論

(1)實驗條件下20 ℃，pH=8.1時，旋鏈角毛藻生長情況最佳。溫度升高對旋鏈角毛藻藻密度及比生長率都有著明顯的抑制作用，相比之下，pH的影響較小。

(2)溫度升高時DMS濃度明顯降低，pH降低時DMS濃度略有減小，這與溫度、pH對藻密度的影響情況相一致，說明溫度升高抑制了藻密度的增長，進而減少了DMS的釋放量。

(3)DMSPt和DMSPd的變化趨勢高度一致，基本都符合先增加后減少的趨勢。溫度升高對DMSP濃度增加有著明顯的抑制作用，而pH的影響較小。

(4)四組實驗中DMS濃度的峰值均出現(xiàn)于藻類生長的衰亡期，表明旋鏈角毛藻衰亡期細胞破裂會導致大量DMSP進入培養(yǎng)液中，降解生成DMS。而藻細胞破裂釋放DMSP過程并不受pH、溫度變化的影響。