張立蘋,吳常寶,牟玉蓮,周偉良,華再東,華文君,李 奎*,畢延震*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064;2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;4.天津市寧河原種豬場,天津 301504)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS，即藍(lán)耳病)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的以妊娠母豬早產(chǎn)、晚期流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障礙及仔豬和生長豬的呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的一種高致死性的傳染病[1-2],由于其傳染快、致死率高,每年都給生豬養(yǎng)殖帶來了巨大的損失。研究證明豬藍(lán)耳病毒是通過單核細(xì)胞膜或巨嗜細(xì)胞膜的CD163受體感染豬,突變CD163基因能夠有效地阻止藍(lán)耳病毒感染單核細(xì)胞或巨嗜細(xì)胞,使豬具有天然抵御藍(lán)耳病毒的能力[3-5]。

血液生理生化指標(biāo)是反映動(dòng)物健康狀況的重要指標(biāo),尤其生化指標(biāo)可以作為遺傳標(biāo)記來預(yù)測動(dòng)物的生產(chǎn)性能,特別是酶活性對確定豬種質(zhì)特性、進(jìn)行選種選配具有更重要的意義[6]。本文以CRISPR/Cas9技術(shù)聯(lián)合體細(xì)胞克隆技術(shù)制備的CD163基因編輯豬(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所制備)為研究對象,檢測21日齡CD163基因編輯豬前腔靜脈血液的生理生化指標(biāo)、免疫球蛋白及補(bǔ)體蛋白等含量,為選育具有天然抵御藍(lán)耳病毒的新品種豬提供基礎(chǔ)的生物學(xué)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選取21日齡健康斷奶仔豬25頭,體重6～7 kg,包括CD163基因突變豬純合子10頭、雜合子10頭,陰性豬5頭,飼養(yǎng)于天津?qū)幒臃N豬場。

1.2 主要試劑

豬免疫球蛋白A(IgA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(19041202M)、豬免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒(19041203M)、豬免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒(19041201M)、豬免疫球蛋白M(IgM)ELISA試劑盒(19041204M)、豬補(bǔ)體蛋白3(C3)ELISA試劑盒(19041205M)、豬補(bǔ)體蛋白4(C4)ELISA試劑盒(19041206M),均購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)為Pointcare M3),購自天津微納芯科技有限公司;高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)為Sigma 3-18k),購自德國Sigma公司;多功能酶標(biāo)儀(型號(hào)為PE Victor X ),購自美國PerkinElmer Victor X 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 前腔靜脈血液的采集

在血液采集前禁食24 h,清晨空腹前腔靜脈采血,由1～2位飼養(yǎng)員將斷奶仔豬抓起,采取正面仰臥保定,將兩前肢稍向兩側(cè)扳開豎起,充分暴露采血部位即兩前肢與氣管交匯處(第一對肋骨與胸骨柄結(jié)合處)。在術(shù)部用碘酊棉球消毒后,采血人員手持帶有9號(hào)枕頭的一次性10 mL注射器,朝采血部位垂直進(jìn)針,邊進(jìn)針邊抽注射器活塞,使針管內(nèi)真空,采集所需血液。用采集血液中的約3 mL制備血清，用于免疫指標(biāo)及補(bǔ)體蛋白指標(biāo)的檢測；將另外的3 mL血液移置于提前準(zhǔn)備好的無菌EDTA抗凝管中，用于生理生化指標(biāo)的檢測。

2.2 血清的制備

將采集的全血于室溫條件下自然凝固30 min,取凝固后的上清液至1.5 mL離心管中,以2000～3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,仔細(xì)收集上清液,要確保收集的上清中無沉淀,如出現(xiàn)沉淀則再次離心,重新收集。

2.3 血液生理指標(biāo)的測定

取20 μL用EDTA抗凝的全血與500 mL稀釋液混勻,用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測,檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞比率(LY)、中間細(xì)胞比率(MID)、粒細(xì)胞比率(GRAN)、淋巴細(xì)胞(LYM)、中間細(xì)胞(MID)、粒細(xì)胞(GRAN)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白濃度(HGB)、血紅蛋白濃度紅細(xì)胞分布寬度SD、血紅蛋白濃度紅細(xì)胞分布寬度CV、血小板總數(shù)(PLT)、血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、血小板壓積(PCT)和血小板大細(xì)胞比率(P-LCR)等共計(jì)20項(xiàng)生理指標(biāo)。

2.4 血液生化指標(biāo)的測定

取20 μL用EDTA抗凝的全血與500 mL稀釋液混勻,用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測,檢測白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、鈣(Ca)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、無機(jī)磷(P)、淀粉酶(AMY)、膽固醇(CHOL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(CRE)、尿素氮/肌酐比(BUN/CRE)和肌酸激酶(CK)等共計(jì)16項(xiàng)生化指標(biāo)。

2.5 血液免疫球蛋白的測定

按照相應(yīng)的豬免疫球蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行檢測,檢測指標(biāo)為免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定OD值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中豬免疫球蛋白含量。

2.6 補(bǔ)體指標(biāo)的測定

按照相應(yīng)的豬補(bǔ)體蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行檢測,檢測指標(biāo)為補(bǔ)體蛋白3(C3)和補(bǔ)體蛋白4(C4)。用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定OD值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中豬補(bǔ)體蛋白含量。

2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件SPSS 19.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 CD163基因編輯對21日齡斷奶仔豬血液生理指標(biāo)的影響

由表1可知,CD163基因編輯后,其中純合子的淋巴細(xì)胞比率、中間細(xì)胞比率、紅細(xì)胞平均體積顯著低于雜合子和陰性豬(P<0.05),純合子的粒細(xì)胞比率、粒細(xì)胞數(shù)顯著高于雜合子和陰性豬(P<0.05),而雜合子的血小板總數(shù)顯著高于純合子和陰性豬(P<0.05),其余指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表1 21日齡CD163基因編輯豬血液生理指標(biāo)檢測結(jié)果

注:同行數(shù)據(jù)后附不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),附相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

3.2 CD163基因編輯對21日齡斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

從表2可以看出,CD163基因編輯后,純合子豬的葡萄糖和膽固醇含量顯著高于雜合子和陰性豬的(P<0.05),其余指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)。

表2 21日齡CD163基因編輯豬血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果

3.3 CD163基因編輯對21日齡斷奶仔豬血液免疫球蛋白含量的影響

由表3可知,CD163基因編輯后,純合子血液中IgG、IgA、IgE和IgM等4類免疫球蛋白的含量均顯著高于雜合子和陰性豬(P<0.05)。

表3 21日齡CD163基因編輯豬免疫球蛋白ELISA檢測結(jié)果

3.4 CD163基因編輯對21日齡斷奶仔豬血液補(bǔ)體蛋白含量的影響

由表4可見,CD163基因編輯后,純合子血液中C3和C4與雜合子和陰性豬沒有顯著性差異(P>0.05)。

表4 21日齡CD163基因編輯豬補(bǔ)體蛋白ELISA檢測結(jié)果

4 討論與結(jié)論

畜禽的生產(chǎn)性能是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)特定生理生化過程的綜合結(jié)果[7]。因此,動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)不僅可以反映動(dòng)物的生理和健康狀況,而且可以作為體現(xiàn)機(jī)體代謝狀況的指標(biāo),在動(dòng)物生產(chǎn)性能及其適應(yīng)性方面的研究中具有重要的參考價(jià)值[8]。同時(shí)動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)也是畜禽飼養(yǎng)、繁殖、保護(hù)和疾病防治的重要參考指標(biāo)[9],可以作為輔助手段應(yīng)用于生產(chǎn)中分類選育及檢驗(yàn)飼養(yǎng)管理是否合理[10-11]。然而,血液中各指標(biāo)的變動(dòng)受畜禽的性別、年齡、營養(yǎng)水平、生活環(huán)境、生理狀態(tài)以及檢測方法等很多因素的影響,但是,在正常情況下,畜禽血液生理生化指標(biāo)具有相對的穩(wěn)定性,這些指標(biāo)的變動(dòng)提示動(dòng)物機(jī)體新陳代謝和生理病理的變化[12]。在本實(shí)驗(yàn)中,選擇健康正常的21日齡CD163基因編輯豬純合子和21日齡CD163基因編輯豬雜合子為研究對象,以健康正常的陰性豬作為對照,檢測了其前腔靜脈血液生理生化指標(biāo),結(jié)果顯示,生理指標(biāo)中變化較大的是淋巴細(xì)胞比率、中間細(xì)胞比率、紅細(xì)胞平均體積,其純合子明顯低于雜合子和陰性豬，然而,其粒細(xì)胞比例要明顯高于雜合子及陰性豬,產(chǎn)生這種情況的原因有待進(jìn)一步研究,但是其余指標(biāo)均無明顯的變化,說明CD163基因編輯對斷奶仔豬的健康狀況基本上沒有影響。

畜禽血液中TP由ALB與GLO構(gòu)成,三者的濃度反映了機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收、合成和分解的基本狀況以及動(dòng)物體對蛋白質(zhì)的消化利用程度和機(jī)體自身的免疫情況[13-14]，而畜禽血液中酶及蛋白水平等生化指標(biāo)是反映動(dòng)物營養(yǎng)水平、新陳代謝能力、機(jī)體健康狀況及生產(chǎn)性能等的重要因素,它在機(jī)體的物質(zhì)代謝、能量傳遞、免疫調(diào)節(jié)和生長發(fā)育等方面都起著十分重要的作用[15]。白蛋白是總蛋白和球蛋白的總稱,其中白蛋白是由肝臟合成并具有維持血漿正常膠體滲透壓和pH值、運(yùn)輸脂肪酸和膽紅素等作用的一類小分子蛋白質(zhì),它是反映機(jī)體健康與否的重要參考指標(biāo),也可以用它來評(píng)價(jià)動(dòng)物抗逆性能的優(yōu)劣,在正常范圍內(nèi),球蛋白含量的高低直接反映了機(jī)體對疾病的抵抗程度[16]。CK通常存在于動(dòng)物心臟、肌肉及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中,是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶[17]。血糖是碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物,是機(jī)體重要的能源,其含量多少可反映機(jī)體能量代謝和糖代謝狀況,低水平的血糖含量是能量缺乏的標(biāo)志。血清總膽固醇含量是機(jī)體脂類代謝的反映,膽固醇在體內(nèi)的主要生理作用是形成膽酸、構(gòu)成細(xì)胞膜、合成激素；同時(shí)甘油三酯含量的高低反映了動(dòng)物機(jī)體對脂類的吸收和代謝狀況[20]。本實(shí)驗(yàn)生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示,CD163基因編輯純合子血液中葡萄糖含量顯著高于雜合子和陰性豬,但是其含量均處于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)正常范圍之內(nèi),說明供試豬機(jī)體內(nèi)葡萄糖代謝是正常的；然而,CD163編輯純合子血液中膽固醇的含量高于雜合子和陰性豬,并且均高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因需要進(jìn)一步深入檢測分析。檢測結(jié)果中其余指標(biāo)在三者之間無顯著差異,表明CD163基因編輯對斷奶仔豬機(jī)體的代謝功能無影響。

免疫球蛋白是指具有抗體活性的動(dòng)物蛋白,是動(dòng)物受抗原刺激后機(jī)體產(chǎn)生的能與抗原特異性相互作用的一類球蛋白,主要存在于動(dòng)物血漿中,也見于其它體液和組織中,參與動(dòng)物體液免疫調(diào)節(jié)。補(bǔ)體蛋白是一種血清蛋白質(zhì),存在于動(dòng)物血清及組織液中,活化后具有酶活性,可介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),可被抗原-抗體復(fù)合物或微生物所激活,導(dǎo)致病原微生物裂解或被吞噬,其中補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4在動(dòng)物血清中的含量高于其他補(bǔ)體成分。本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明,CD163基因編輯純合子前腔靜脈血液中IgG、IgA、IgE和IgM等4類免疫球蛋白的含量均顯著高于雜合子和陰性豬,說明21日齡CD163基因純合子的免疫力要強(qiáng)于雜合子和陰性豬；但是血清中補(bǔ)體蛋白水平在三者之間無顯著差異,其原因需要進(jìn)一步深入研究。

本文測定的數(shù)據(jù)表明,該CD163基因編輯豬具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)等優(yōu)勢,在生長發(fā)育方面有不同程度的改善和提高,部分血液生理生化指標(biāo)的變化表現(xiàn)其在特定生態(tài)條件和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下的特異性,本研究結(jié)果可為該抗病豬的選育及品種開發(fā)利用等方面提供參考依據(jù)。