撒 琪 任貴生 徐孝東 郭錦洲 陳文萃 趙 亮 劉志紅 黃湘華

系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性(AL)，是由單克隆免疫球蛋白輕鏈錯(cuò)誤折疊形成淀粉樣蛋白在組織器官沉積，造成組織結(jié)構(gòu)破壞、器官功能障礙并進(jìn)行性進(jìn)展的疾病[1]。可累及全身多個(gè)器官，臨床表現(xiàn)多樣，預(yù)后差，臨床診斷主要依賴于組織活檢[2-4]。單克隆免疫球蛋白主要來源于骨髓中異常克隆性漿細(xì)胞，利用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(multiparametric flow cytometry，MFC)檢測AL患者骨髓漿細(xì)胞，識(shí)別惡性漿細(xì)胞對(duì)疾病的診斷和治療具有重要意義，且相對(duì)于組織活檢，骨髓穿刺創(chuàng)傷較小。目前，AL單克隆漿細(xì)胞表型特征，不同漿細(xì)胞病之間漿細(xì)胞數(shù)量與免疫表型差異尚未十分明確，缺乏大樣本研究。

本研究回顧性觀察AL患者的臨床特征，利用MFC對(duì)骨髓漿細(xì)胞進(jìn)行檢測，通過比較AL與非AL的具有腎臟意義的單克隆免疫球蛋白血癥(MGRS)、MM患者骨髓漿細(xì)胞數(shù)量及表型差異，分析AL單克隆漿細(xì)胞數(shù)量、免疫表型特征，探究兩者與疾病風(fēng)險(xiǎn)分層的關(guān)系。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象2015年5月至2018年9月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心住院治療的AL患者119例，對(duì)照組非AL的MGRS患者 49例，MM患者 19例。所有患者均有以下表現(xiàn)：(1)存在蛋白尿和(或)腎功能不全[估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)<60 ml/(min·1.73m2)]；(2)血液/尿液/組織中檢出單克隆免疫球蛋白或骨髓檢查發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞異常增生。

臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)收集患者性別、年齡、24h尿蛋白、血白蛋白、球蛋白、尿素氮、血清肌酐、尿酸、堿性磷酸酶、白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)、血游離輕鏈差值(dFLC)、N-末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、肌鈣蛋白T(TnT)、血免疫固定電泳等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及器官受累情況。

相關(guān)定義AL及器官受累診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性診斷和治療指南》(2016年)[1]，腎臟：24h尿蛋白定量>0.5g，以白蛋白為主；心臟：心臟超聲平均心室壁厚度>12 mm，排除其他心臟疾病；或是在無腎功能不全及心房顫動(dòng)時(shí)NT-proBNP>332 ng/L；肝臟：無心力衰竭時(shí)肝上下徑(肝叩診時(shí)鎖骨中線上測量的肝上界到肝下界的距離)>15 cm；或堿性磷酸酶大于正常值上限的1.5倍；外周神經(jīng)：臨床出現(xiàn)對(duì)稱性雙下肢感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變。MGRS診斷參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，多發(fā)性骨髓瘤(MM)診斷參考《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2017年修訂)》[7]。

研究方法

儀器與試劑MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選系統(tǒng)(Beckman Coulter公司)，配置488 mm和633 mm激光器，采用六色熒光標(biāo)記技術(shù)，用RPE-TR、APC、APC-Cy7、RPC-Cy7、CD117-UV1、RPE-Cy5分別標(biāo)記胞膜CD19、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138抗體。熒光標(biāo)記的κ和λ游離輕鏈抗體。以上試劑及溶血素、細(xì)胞固定液和透膜液均購自Beckman Coulter公司。

樣品制備無菌操作抽取患者骨髓液，取0.2 ml涂片進(jìn)行骨髓形態(tài)學(xué)檢測；另取2 ml于肝素抗凝管中4℃低溫保存，于48h內(nèi)進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，CD19、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138、κ和λ抗體染色處理待測。

形態(tài)學(xué)檢測骨髓涂片經(jīng)瑞氏—吉姆薩染色，光鏡下觀察并分類計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞。

MFC檢測用流式細(xì)胞儀(MoFlo XDP，Beckman Coulter公司)分析樣品。每次記錄至少10萬個(gè)細(xì)胞。用BD CellQuest Pro軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)指定骨髓有核細(xì)胞的閾值門控以排除紅細(xì)胞，死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。采用CD38/CD138設(shè)門策略圈定雙陽性細(xì)胞，分析該群細(xì)胞其他表面抗原的表達(dá)情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用《SPSS18.0》軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般資料本研究納入AL患者119例，男性61例，女性58例，中位年齡55歲。對(duì)照組納入非AL的MGRS 49例(包括伴單克隆免疫球蛋白沉積的增生性腎小球腎炎27例，單克隆免疫球蛋白沉積病16例，輕鏈沉積病3例，重鏈沉積病2例，輕重鏈型淀粉樣變性1例)，MM 19例。所有患者基線臨床特征見表1。

表1 三組患者臨床基線資料

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MGRS：具有腎臟意義的單克隆免疫球蛋白血癥；MM：多發(fā)性骨髓瘤；dFLC：游離輕鏈差值；NT-proBNP ：N-末端腦鈉肽前體；TnT：肌鈣蛋白T；P1：AL組vs非AL的MGRS組；P2：AL組vsMM組

漿細(xì)胞數(shù)量特征AL患者骨髓形態(tài)學(xué)檢測總漿細(xì)胞比例2%(0.5%，4%)，MFC檢測總漿細(xì)胞比例0.61%(0.3%，1.21%)，其中單克隆漿細(xì)胞比例0.42%(0.07%，0.99%)。無論是形態(tài)學(xué)檢測還是MFC檢測，AL患者骨髓漿細(xì)胞數(shù)量高于MGRS(P<0.001)，低于MM(P<0.001)；MFC檢測單克隆漿細(xì)胞數(shù)量也呈現(xiàn)上述規(guī)律(表2)。

表2 3組患者漿細(xì)胞數(shù)量及單克隆漿細(xì)胞抗原表達(dá)情況

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MM：多發(fā)性骨髓瘤；MGRS：具有腎臟意義的單克隆免疫球蛋白血癥；MFC：多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)；P1：AL組vs非AL的MGRS組；P2：AL組vsMM組

漿細(xì)胞免疫表型特征119例AL患者中有96例(80.7%)檢測出輕鏈限制性，其中83例(86.5%)限制性表達(dá)λ輕鏈，單克隆漿細(xì)胞免疫表型主要為CD19-(89.6%，86/96)、CD56+(71.9%，69/96)、CD117-(53.1%，51/96)。

與MM、MGRS相比，AL單克隆漿細(xì)胞表面CD117陽性率明顯較高(P=0.001)；且限制性表達(dá)λ輕鏈更為顯著(P=0.002)(表2)。此外，與MGRS相比，AL單克隆漿細(xì)胞表達(dá)CD19的比例更低(P<0.001)。

AL患者單克隆漿細(xì)胞數(shù)量與免疫表型的相關(guān)性分析根據(jù)單克隆漿細(xì)胞表面CD19、CD56、CD117抗原分子表達(dá)情況對(duì)漿細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)CD19陰性組患者M(jìn)FC檢測骨髓漿細(xì)胞數(shù)量為0.77%(0.42%，1.43%)，明顯高于CD19陽性組0.36%(0.16%，0.83%)(P=0.013)(表3)。CD56、CD117組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 AL患者單克隆漿細(xì)胞數(shù)量與免疫表型的相關(guān)性

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MFC：多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)

AL疾病風(fēng)險(xiǎn)分層與漿細(xì)胞數(shù)量、免疫表型的關(guān)系根據(jù)Mayo分期系統(tǒng)(修訂版)[8]，將AL淀粉樣變性患者分為Ⅰ～Ⅳ期。MFC檢測單克隆漿細(xì)胞比例最高的為Ⅳ期0.98%(0.6%，1.37%)，最低為Ⅱ期0.53%(0.29%，1.03%)Ⅳ期與Ⅱ期兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)；而形態(tài)學(xué)檢測四組患者骨髓漿細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。比較單克隆漿細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況，CD117在Ⅰ～Ⅳ期患者中的陽性率分別為61.3%、33.3%、30.8%、75%。CD117在Ⅳ期患者中陽性率明顯高于Ⅱ、Ⅲ期患者(P=0.032，P=0.021)；在Ⅰ期患者中比例也較高，與Ⅱ期患者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。

表4 AL患者M(jìn)ayo分期(修訂版)[8]與單克隆漿細(xì)胞抗原表達(dá)情況

AL：系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性；MFC：多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)

討 論

AL是一種漿細(xì)胞疾病，其特征是骨髓中存在一群產(chǎn)生κ或λ輕鏈的克隆性漿細(xì)胞，其過度產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊的免疫球蛋白輕鏈形成不溶性纖維在組織器官沉積，從而對(duì)機(jī)體造成損害[9]。單克隆漿細(xì)胞準(zhǔn)確識(shí)別和特異性表型分析對(duì)AL淀粉樣變性的疾病診斷、療效和預(yù)后評(píng)估具有重要作用。由于異?？寺〉臐{細(xì)胞數(shù)量少，形態(tài)變化小，且與正常漿細(xì)胞共存，用傳統(tǒng)的骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢測很難識(shí)別[10]。MFC免疫表型分析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于白血病、淋巴增殖性疾病的診斷和監(jiān)測[9]，在MM中有較為成熟的應(yīng)用。近年來越來越多的研究關(guān)注到在MFC在AL型淀粉樣變性中的潛在價(jià)值，免疫表型分析與輕鏈限制性檢測可有效識(shí)別惡性漿細(xì)胞，輔助臨床診斷。但是，目前尚缺乏大樣本的研究，關(guān)于克隆性漿細(xì)胞的數(shù)據(jù)尤其是免疫表型特征的數(shù)據(jù)仍然有限，未能明確定義AL單克隆漿細(xì)胞免疫表型譜；免疫表型與患者臨床特征、疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的關(guān)系有待深入探索。

本研究共收集119例AL、49例非AL的 MGRS、19例MM患者骨髓進(jìn)行MFC檢測。AL患者中有96例(80.7%)檢測到漿細(xì)胞輕鏈限制性，其中83例(86.5%)限制性表達(dá)λ輕鏈；對(duì)比免疫固定電泳結(jié)果119例AL患者有71例(59.7%)檢測到單克隆條帶，MFC檢測漿細(xì)胞輕鏈限制性靈敏度明顯更高(P<0.001)。AL單克隆漿細(xì)胞免疫表型主要為CD19-(89.6%，86/96)、CD56+(71.9%，69/96)、CD117-(53.1%，51/96)。與Hu等[11]報(bào)道51例AL患者CD117陽性率為68.6%略有不同的是，本研究中CD117的陽性率僅46.9%，超過一半的患者(53.1%)骨髓單克隆漿細(xì)胞CD117為陰性。與MM、MGRS患者相比，AL患者骨髓單克隆漿細(xì)胞表面CD117的陽性率更高。CD117是具有酪氨酸激酶活性的造血生長因子受體，正常骨髓漿細(xì)胞一般不表達(dá)CD117。以往研究發(fā)現(xiàn)在MM中CD117陽性與良好的預(yù)后相關(guān)[12-14]。在AL淀粉樣變性中，CD117是否與預(yù)后相關(guān)尚需進(jìn)一步的探究。

漿細(xì)胞數(shù)量對(duì)于AL型淀粉樣變性的疾病診斷和預(yù)后評(píng)估也具有重要意義。對(duì)比AL、MM、非AL的 MGRS三組間的漿細(xì)胞負(fù)荷，無論是形態(tài)學(xué)檢測還是MFC檢測，AL骨髓漿細(xì)胞數(shù)量高于MGRS而低于MM；MFC檢測單克隆漿細(xì)胞數(shù)量同樣是AL高于非AL的 MGRS而低于MM。這一結(jié)果與Diao等[15]的研究一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)單克隆漿細(xì)胞CD19表達(dá)缺失的患者骨髓漿細(xì)胞數(shù)量高于表達(dá)CD19的患者(P=0.013)，提示CD19缺失的單克隆漿細(xì)胞惡性程度高于CD19陽性單克隆漿細(xì)胞。CD19是表達(dá)與B淋巴細(xì)胞及濾泡樹突狀細(xì)胞的表面蛋白，在B細(xì)胞成熟并最終分化為漿細(xì)胞的整個(gè)過程中都有表達(dá)[16]。CD19是B細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)復(fù)合體的組成之一，發(fā)揮降低B細(xì)胞分裂及分化所必需的抗原濃度閾值的作用[17]。正常漿細(xì)胞通常表達(dá)CD19，在一項(xiàng)685例MM的研究中發(fā)現(xiàn)只有4%的患者表達(dá)CD19[18]。因此，CD19可作為鑒別正常與異常漿細(xì)胞的標(biāo)志。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在MM中CD19缺失與疾病進(jìn)展相關(guān)[19]。但CD19在AL中是否與疾病進(jìn)展相關(guān)尚無報(bào)道。

為進(jìn)一步探究漿細(xì)胞數(shù)量、免疫表型與疾病風(fēng)險(xiǎn)分層之間的關(guān)系，本研究根據(jù)2012年Mayo分期系統(tǒng)對(duì)AL患者進(jìn)行分組[8]。 MFC檢測單克隆漿細(xì)胞數(shù)量最高的為Ⅳ期患者，揭示疾病風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)高的患者漿細(xì)胞負(fù)荷高，且相較于數(shù)量最低的Ⅱ期患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)；而形態(tài)學(xué)檢測漿細(xì)胞數(shù)量在4組患者中未能發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示通過MFC檢測AL患者骨髓中單克隆漿細(xì)胞數(shù)量可預(yù)測患者的疾病風(fēng)險(xiǎn)。有趣的是，不同分期患者CD117呈現(xiàn)差異表達(dá)，在Ⅰ期和Ⅳ期患者陽性率較高。

本研究尚存在不足之處：(1)對(duì)照組納入的MM病例數(shù)相對(duì)不足，在疾病間比較時(shí)可能存在偏倚；(2)僅從橫斷面分析漿細(xì)胞數(shù)量及表型特征，缺乏治療后的監(jiān)測；(3)對(duì)患者觀察隨訪時(shí)間短，不同表型患者生存及預(yù)后是否存在差異尚需進(jìn)一步探究。

小結(jié)：利用MFC可有效測定AL患者骨髓中漿細(xì)胞數(shù)量，識(shí)別漿細(xì)胞克隆性。對(duì)單克隆漿細(xì)胞數(shù)量的檢測和免疫表型的分析在AL的診斷、鑒別診斷與疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有重要意義，有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。