竇曹帥 張 鴻 柯貴寶 連智雯 陳雪芹1, 史 偉 梁馨 劉雙信1,

蛋白尿通常與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)[1]，足細(xì)胞損傷及數(shù)量減少可直接導(dǎo)致蛋白尿和腎小球硬化[2]，但其損傷機(jī)制尚不完全清楚。Krüppel樣因子15(KLF15)是KLFs轉(zhuǎn)錄因子家族成員，C端包含與DNA區(qū)域連接的鋅指結(jié)構(gòu)，N端是一段高度保守的區(qū)域[3]，在腎臟中表達(dá)豐富[4]，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，KLF15可減弱足細(xì)胞損傷[5]，缺少KLF15的小鼠加速慢性足細(xì)胞損傷進(jìn)展[6]，糖皮質(zhì)激素可顯著提高足細(xì)胞中KLF15的表達(dá)，并促進(jìn)足細(xì)胞分化[7]，但具體分子機(jī)制尚不明確。

核轉(zhuǎn)錄因子——活化T細(xì)胞核因子胞質(zhì)1型(Nuclear factor of activated T cytoplasmic 1，NFATc1)靜息狀態(tài)下以磷酸化形式存在于胞質(zhì)中，Ca2+流入后活化鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)NFATc1脫磷酸入核介導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄，從而引起足細(xì)胞損傷[8]。我們課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，NFATc1活化在足細(xì)胞損傷、凋亡以及腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。近來有文獻(xiàn)報(bào)道，糖皮質(zhì)激素可顯著提高KLF15的表達(dá)，并通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)KLF15與NFATc1啟動(dòng)子區(qū)域有結(jié)合[7]。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究KLF15是否通過影響NFATc1保護(hù)足細(xì)胞，并進(jìn)一步完善糖皮質(zhì)激素保護(hù)足細(xì)胞的分子機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)試劑RMPI 1640培養(yǎng)基(CORNING)；重組小鼠γ干擾素(IFN-γ)(ProSpec)；胎牛血清(FBS)；0.05%胰酶(Gibco)；核漿蛋白提取試劑盒、凋亡試劑盒(凱基)；ChIP試劑盒、熒光二抗488、熒光二抗555(Thermo)；NFATc1抗體(Abcam)；GAPDH 抗體(Bioworld)；BAX、KLF15抗體(Santa)；BCL2、Histone 抗體(CST)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol、lipofectamine 2000(LifeTechnologies)；SYBR GREEN(Takara)；增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)。

細(xì)胞培養(yǎng)條件永生化小鼠足細(xì)胞系由美國Jochen Reiser教授(Rush University Medical Center，Chicago，IL，USA)惠贈(zèng)。足細(xì)胞復(fù)蘇后在含10% FBS 及(2～10)×104U/L 的 IFN-γ培養(yǎng)基、33 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中增殖，細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)入 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中在5% FBS 及不含IFN-γ的培養(yǎng)基中分化，在37 ℃培養(yǎng)10～12d，足細(xì)胞分化成熟。本研究所做實(shí)驗(yàn)均在分化成熟后進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)分組

免疫熒光分組 腎癌患者周邊正常腎組織(Normal組)；糖尿病腎病患者腎穿組織標(biāo)本(DN組)；微小病變型腎病患者腎穿組織標(biāo)本(MCD組)；局灶節(jié)段性腎小球硬化患者腎穿組織標(biāo)本(FSGS組)。

足細(xì)胞損傷刺激分組 CON組：空白對(duì)照組；脂多糖(LPS)組：含100 μg/ml的LPS培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；HG組：含30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h；阿霉素(ADR)組：含0.25 μg/ml ADR培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

足細(xì)胞過表達(dá)及過表達(dá)損傷處理分組 EGFP組：腺病毒瞬時(shí)感染過表達(dá)對(duì)照組；KLF15組：腺病毒瞬時(shí)感染過表達(dá)KLF15組；EGFP+LPS組：過表達(dá)對(duì)照后加入LPS干預(yù)24h；EGFP+HG組：過表達(dá)對(duì)照后加入高糖干預(yù)24h；EGFP+ADR組：過表達(dá)對(duì)照后加入ADR干預(yù)24h；KLF15+LPS組：過表達(dá)KLF15后加入LPS干預(yù)24h。KLF15+HG組：過表達(dá)KLF15后加入高糖干預(yù)24h；KLF15+ADR組：過表達(dá)KLF15后加入ADR干預(yù)24h。

足細(xì)胞地塞米松處理分組 0h：空白對(duì)照組；6h：地塞米松(10 μmol/L)處理6h組；12h：地塞米松處理12h組；24h：地塞米松處理24h組；48h：地塞米松處理48h組。

病毒感染足細(xì)胞分化成熟后，在5 ml不含血清RMPI 1640培養(yǎng)基中加入5 μl病毒，24h后換為含5%血清的RMPI 1 640培養(yǎng)基，再做其他干預(yù)。

地塞米松處理8 ml 5%血清的RMPI 1 640培養(yǎng)基加入2 μl 40 mmol/L地塞米松后培養(yǎng)6h、12h、24h、48h。

WesternBlot 細(xì)胞干預(yù)到時(shí)間后，每皿加入100 μl蛋白裂解液刮取蛋白，BCA法測(cè)得蛋白濃度后按照20∶ 1加入變性液，98℃變性10 min，按照每孔60 μg上樣蛋白，80V恒壓電泳分離后，200 mA恒流120 min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%牛奶封閉1h，一抗4℃孵育過夜，用相應(yīng)二抗4℃孵育2h，用電化學(xué)發(fā)光液(ECL)曝光，Image J軟件分析灰度值。

實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA,按照SYBR-Green PCR試劑盒說明檢測(cè)目的基因表達(dá)。引物序列：GAPDH正義鏈5′-A￣G￣G￣T￣C￣G￣G￣T￣G￣T￣G￣A￣A￣C￣G￣G￣A￣T￣T￣T￣G-3′，反義鏈5′-T￣G￣T￣A￣G￣A￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣G￣A￣G￣G￣T￣C￣A-3； NFATc1正義鏈5’-G￣G￣A￣G￣A￣G￣T￣C￣C￣G￣A￣G￣A￣A￣T￣C￣G￣A￣G￣A￣T-3’反義鏈5’-T￣T￣G￣C￣A￣G￣C￣T￣A￣G￣G￣A￣A￣G￣T￣A￣C￣G￣T￣C￣T-3’;KLF15正義鏈5’-G￣A￣G￣A￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣C￣G￣T￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣A￣A-3’,反義鏈5’-G￣C￣T￣G￣G￣A￣G￣A￣C￣A￣T￣C￣G￣C￣T￣G￣T￣C￣A￣T-3’;BAX正義鏈5’-A￣G￣A￣C￣A￣G￣G￣G￣G￣C￣C￣T￣T￣T￣T￣T￣G￣C￣T￣A￣C-3’反義鏈5’-A￣A￣T￣T￣C￣G￣C￣C￣G￣G￣A￣G￣A￣C￣A￣C￣T￣C￣G-3’; BCL2 正義鏈5’-G￣C￣T￣A￣C￣C￣G￣T￣C￣G￣T￣G￣A￣C￣T￣T￣C￣G￣C-3’反義鏈 5’-C￣C￣C￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣A￣C￣T￣C￣A￣A￣A￣G￣A￣A￣G￣G￣F￣Z￣D9-3’;FZD9正義鏈5’-C￣G￣C￣A￣C￣G￣C￣A￣C￣T￣C￣T￣G￣T￣A￣T￣G￣G￣A￣G-3’，反義鏈 5’-G￣C￣C￣G￣A￣G￣A￣C￣C￣A￣G￣A￣A￣C￣A￣C￣C￣TC-3’；RCAN1正義鏈 5’-C￣T￣C￣C￣T￣C￣C￣C￣G￣T￣T￣G￣G￣C￣T￣G￣G￣A￣A￣A-3’，反義鏈 5’-C￣T￣G￣G￣G￣A￣G￣T￣G￣G￣T￣G￣T￣C￣T￣G￣T￣C￣G￣C-3’; PLARU正義鏈 5’-G￣A￣C￣T￣A￣C￣C￣G￣T￣G￣C￣T￣T￣C￣G￣G￣G￣A￣A￣T￣G -3’，反義鏈5’-A￣T￣G￣G￣T￣C￣C￣T￣G￣T￣T￣G￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣T￣C￣G-3’。

免疫熒光腎組織先進(jìn)行冰甲醇固定15～20 min、0.5% trionx-100透化10 min、5%BSA封閉30 min，再孵育一抗4℃過夜，然后用相應(yīng)的熒光二抗避光孵育15 min，DAPI染核15 min，封片，共聚焦顯微鏡下觀察，所用圖片均在400倍油鏡下拍攝。

染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin Immunoprecipitation，CHIP)：甲醛處理并收集足細(xì)胞，超聲破碎，然后加入KLF15抗體，與KLF15蛋白-NFATc1 DNA復(fù)合物相互結(jié)合，加入Protein A結(jié)合KLF15抗體-KLF15蛋白-NFATc1 DNA復(fù)合物，并沉淀，清洗，得到富集的KLF15蛋白-NFATc1 DNA復(fù)合物，加熱解交聯(lián)，純化富集的NFATc1 DNA片斷通過PCR分析，PCR特異擴(kuò)增NFATc1啟動(dòng)子-984/-1 861 bp區(qū)域，引物序列NFATc1正義鏈5’-T￣C￣C￣C￣C￣A￣A￣G￣G￣T￣C￣T￣C￣G￣G￣G￣T￣G￣G￣G-3’，反義鏈5’-T￣T￣C￣C￣G￣T￣C￣C￣C￣C￣G￣C￣C￣C￣T￣T￣C￣C￣C￣T-3’。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組足細(xì)胞，用Binding Buffer重懸足細(xì)胞，在足細(xì)胞懸液中先加入Annexin V-APC避光孵育15 min，再加入PI后，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用《SPSS 22.0》進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

KLF15在腎小球疾病患者的足細(xì)胞中表達(dá)降低用免疫熒光染色通過synaptopodin定位足細(xì)胞，觀察正常腎小球足細(xì)胞與病變腎小球足細(xì)胞中KLF15的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常腎小球相比，病變腎小球足細(xì)胞中的KLF15的表達(dá)明顯降低(圖1)。

足細(xì)胞KLF15在損傷刺激后表達(dá)明顯降低足細(xì)胞用含0.25 μg/ml ADR、含30 mmol/L葡萄糖、含100 μg/L LPS的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h、48h、48h，通過RT-PCR和Western Blot檢測(cè)KLF15的mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比,ADR組、LPS組以及HG組中KLF15的表達(dá)明顯降低(圖2)。

圖2 KLF15在ADR、LPS、HG刺激體外培養(yǎng)的足細(xì)胞中表達(dá)降低A：KLF15的mRNA水平表達(dá)；B、C：KLF15的蛋白水平表達(dá)；KLF15：Krüppel樣因子15；CON：空白對(duì)照組；ADR：阿霉素；LPS：脂多糖；HG：高糖；*：與CON組相比P<0.05,**: 與CON組相比P<0.01,***: 與CON組相比P<0.001

過表達(dá)KLF15對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用通過腺病毒感染足細(xì)胞過表達(dá)KLF15后，通過RT-PCR、Western Blot驗(yàn)證KLF15的過表達(dá)效率，結(jié)果顯示過表達(dá)效率很高(圖3A、B)；足細(xì)胞在過表達(dá)KLF15后通過Western Blot、RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，在mRNA及蛋白水平，促凋亡蛋白BAX表達(dá)降低(P<0.01)，抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)升高(P<0.05)(圖3C、D)；分別在含有LPS(100 μg/ml)、ADR(0.25 μg/ml)、HG(30 mmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KLF15組比對(duì)照組凋亡減少(P<0.05)見圖3E、圖3F，過表達(dá)KLF15后給予ADR、LPS、HG等培養(yǎng)后與對(duì)照組給予ADR、LPS、HG培養(yǎng)相比凋亡減少(P<0.05)(圖3G～L)。

轉(zhuǎn)錄因子KLF15對(duì)NFATc1表達(dá)的調(diào)控足細(xì)胞過表達(dá)KLF15后，通過RT-PCR、 western blot檢測(cè)NFATc1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KLF15后NFATc1的表達(dá)降低(P<0.05)(圖4A、B)；足細(xì)胞LPS(100 μg/ml)處理48h后，按照ChIP試劑盒的操作流程，通過普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、RT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子KLF15與NFATc1的啟動(dòng)子區(qū)域存在結(jié)合，并且在LPS刺激后結(jié)合減少(P<0.001)(圖4C、D)；KLF15可通過結(jié)合NFATc1抑制其下游靶基因FZD9、RCAN1、PLAUR表達(dá)，從而抑制NFATc1活性(圖4E)。

地塞米松通過KLF15保護(hù)足細(xì)胞的機(jī)制有研究發(fā)現(xiàn)[7]，糖皮質(zhì)激素可通過升高KLF15的表達(dá)促進(jìn)足細(xì)胞分化，本研究通過對(duì)足細(xì)胞在含10umol/L地塞米松培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時(shí)間段后用RT-PCR檢測(cè)KLF15的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在含地塞米松培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h、12h、24h、48h后，KLF15的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)(圖5A)；通過RT-PCR及Western Blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)足細(xì)胞中NFATc1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NFATc1的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，其中以24h最為明顯(P<0.01)(圖5B、C)。

圖3 過表達(dá)KLF15對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響A、B：mRNA、蛋白水平驗(yàn)證過表達(dá)KLF15效率；C：過表達(dá)KLF15后BAX、BCL2的mRNA表達(dá)；D：過表達(dá)KLF15后BAX、BCL2的蛋白表達(dá)；E：EGFP組流式凋亡圖；F：KLF15組流式凋亡圖；G：EGFP+ADR組流式凋亡圖；H：KLF15+ADR組流式凋亡圖；I：EGFP+LPS組流式凋亡圖；J：KLF15+LPS組流式凋亡圖；K：EGFP+HG組流式凋亡圖；L：KLF15+HG組流式凋亡圖；M：細(xì)胞凋亡定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；KLF15：Krüppel樣因子15；BAX：促凋亡蛋白；BCL2：抗凋亡蛋白；EGFP：增強(qiáng)綠色熒光蛋白；ADR：阿霉素；LPS：脂多糖；HG：高糖； *：與對(duì)照組相比P<0.05,**: 與對(duì)照組相比P<0.01，***: 與對(duì)照組相比P<0.001

圖4 轉(zhuǎn)錄因子KLF15對(duì)NFATc1表達(dá)的調(diào)控CON：空白對(duì)照組，LPS：脂多糖處理組，Input：陽性對(duì)照組，IgG組抗體為IgG(陰性對(duì)照組)，KLF15組抗體為KLF15;A：RT-PCR示過表達(dá)KLF15后NFATc1的mRNA表達(dá)；B：Western Blot示過表達(dá)KLF15后NFATc1蛋白表達(dá)；C：染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)后普通瓊脂糖凝膠電泳，引物為針對(duì)NFATc1的啟動(dòng)子區(qū)域序列；D：CHIP針對(duì)NFATc1啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行的RT-PCR定量分析(C、D兩者為不同類型實(shí)驗(yàn))；E：NFATc1下游靶基因mRNA表達(dá)； *：與對(duì)照組相比，P<0.05；**：與對(duì)照組相比，P<0.01；***:與對(duì)照組相比，P<0.001；NFATc1:活化T細(xì)胞核因子胞質(zhì)1型

圖5 地塞米松處理不同時(shí)間點(diǎn)NFATc1、KLF15表達(dá)NFATc1:活化T細(xì)胞核因子胞質(zhì)1型;KLF15:Krüppel樣因子15;A：地塞米松處理不同時(shí)間點(diǎn)足細(xì)胞中KLF15的mRNA表達(dá)水平；B： 地塞米松處理不同時(shí)間點(diǎn)足細(xì)胞中NFATc1 mRNA表達(dá)；C、D：地塞米松處理不同時(shí)間點(diǎn)足細(xì)胞中NFATc1的蛋白表達(dá)；*：與對(duì)照組(0h)相比，P<0.05,**：與對(duì)照組(0h)相比，P<0.01

討 論

蛋白尿是導(dǎo)致終末期腎病的重要危險(xiǎn)因素之一[9]，足細(xì)胞作為腎臟濾過功能的最后屏障，足細(xì)胞損傷是蛋白尿產(chǎn)生的重要病理基礎(chǔ)。足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病及其他導(dǎo)致蛋白尿腎病中常表現(xiàn)為足突融合[10]，進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞的死亡、脫落及數(shù)量減少，但足細(xì)胞的損傷機(jī)制尚不完全清楚，是近年來慢性腎病的研究熱點(diǎn)。

KLF15是轉(zhuǎn)錄因子Krüppel-like factors家族中的一員，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，與果蠅的Krüppel蛋白結(jié)合[3]。人體內(nèi)已被發(fā)現(xiàn)的KLFs包含KLF1-KLF18，已知KLF2、KLF4、KLF5、KLF6、KLF15參與到腎臟疾病調(diào)節(jié)中。有研究發(fā)現(xiàn)，KLF15是促進(jìn)果蠅腎原細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]；KLF15參與調(diào)節(jié)足細(xì)胞的分化，敲除KLF15的小鼠與野生型相比有更嚴(yán)重的蛋白尿，并且足細(xì)胞分化減少[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在腎小球疾病患者足細(xì)胞中KLF15的表達(dá)降低；通過給予足細(xì)胞ADR、LPS、HG三種損傷處理發(fā)現(xiàn)KLF15的表達(dá)明顯下調(diào)；通過對(duì)足細(xì)胞過表達(dá)KLF15后發(fā)現(xiàn)，促凋亡蛋白BAX表達(dá)降低，抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)升高，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KLF15后，足細(xì)胞凋亡降低，而且在損傷刺激下的足細(xì)胞，過表達(dá)KLF15后相比于對(duì)照組，凋亡明顯下降，進(jìn)一步說明KLF15可顯著減少足細(xì)胞損傷，這提示，KLF15在足細(xì)胞中是一個(gè)保護(hù)性因子，而KLF15保護(hù)足細(xì)胞的具體機(jī)制尚不明確。

以往研究發(fā)現(xiàn)[13]，生理狀態(tài)的NFAT磷酸化位于細(xì)胞漿中，經(jīng)典的CaN-NFATc1調(diào)節(jié)通路中，在損傷刺激時(shí)，Ca2+流入后活化鈣調(diào)磷酸酶(CaN)介導(dǎo)NFATc1脫磷酸入核從而介導(dǎo)下游靶基因FZD9、RCAN1、PLARU轉(zhuǎn)錄,FZD9、RCAN1的轉(zhuǎn)錄可直接導(dǎo)致足細(xì)胞功能紊亂[14]，PLAUR編碼蛋白u(yù)PAR增加足細(xì)胞的活動(dòng)性可促進(jìn)足細(xì)胞的脫落，引起足細(xì)胞損傷[15]；NFATc1的活化可通過升高促凋亡蛋白BAX促進(jìn)足細(xì)胞凋亡[16]，導(dǎo)致腎小球硬化[14]，除此之外，NFATc1還被發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病中活性增強(qiáng)，參與到糖尿病腎病足細(xì)胞損傷進(jìn)程[17]；國內(nèi)外研究及本課題組[8,17-19]發(fā)現(xiàn)，RANK，ATF3,SOS2等分子都可通過調(diào)節(jié)NFATc1影響足細(xì)胞損傷；有研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)[7]，KLF15與NFATc1的啟動(dòng)子區(qū)域可能存在結(jié)合。本研究通過對(duì)足細(xì)胞過表達(dá)KLF15觀察NFATc1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KLF15的足細(xì)胞NFATc1的表達(dá)明顯下調(diào)，并通過CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，KLF15與NFATc1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，并在損傷刺激下結(jié)合減弱，足細(xì)胞過表達(dá)KLF15后NFATc1的下游靶基因FZD9、RCAN1、PLAUR表達(dá)減少，表明KLF15可通過抑制NFATc1的表達(dá)而保護(hù)足細(xì)胞。

糖皮質(zhì)激素因?yàn)槠鋸?qiáng)大的抗炎作用而被廣泛用于各種腎臟疾病的治療中，研究證實(shí)，人類足細(xì)胞中存在糖皮質(zhì)激素受體[20]，糖皮質(zhì)激素可以直接對(duì)足細(xì)胞起作用并對(duì)足細(xì)胞分化有著重要作用[21-22]，但糖皮質(zhì)激素對(duì)于足細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)[7]，糖皮質(zhì)激素可通過升高KLF15的表達(dá)來促進(jìn)足細(xì)胞分化，在LPS誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中，地塞米松可明顯改善小鼠蛋白尿水平，而在KLF15敲除鼠中，地塞米松不能改善小鼠蛋白尿，說明KLF15表達(dá)受抑制后地塞米松的治療效果明顯降低，KLF15是地塞米松的直接治療靶點(diǎn)。本研究中，通過用地塞米松處理足細(xì)胞6h、12h、24h、48h發(fā)現(xiàn)，KLF15的表達(dá)水平顯著升高，并且NFATc1的表達(dá)降低，表明糖皮質(zhì)激素有可能通過KLF15-NFATc1通路保護(hù)足細(xì)胞。

本研究首次探討了轉(zhuǎn)錄因子KLF15通過抑制NFATc1信號(hào)通路保護(hù)足細(xì)胞的可能機(jī)制，豐富了NFATc1的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，在經(jīng)典CaN-NFATc1通路之外從基因轉(zhuǎn)錄水平探索了NFATc1調(diào)節(jié)新思路，為臨床治療蛋白尿及慢性腎小球疾病提供新策略；KLF15是否還通過其他分子途徑保護(hù)足細(xì)胞尚待進(jìn)一步探索；本研究還初步探索了糖皮質(zhì)激素保護(hù)足細(xì)胞可能的新的分子機(jī)制，豐富了糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)制，但糖皮質(zhì)激素是否通過KLF15抑制NFATc1、糖皮質(zhì)激素在ADR、HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的治療效果尚待進(jìn)一步研究。