張穎超 米 焱 綜述 王彩麗， 李 禮 審校

全球糖尿病患者總?cè)藬?shù)將從2010年的2.85億在2030年激增到4.39億,糖尿病是危害公眾健康的主要病因之一[1]，大約有25%～40%的糖尿病患者會最終發(fā)展為糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)。DN是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，以及終末期腎病的重要病因，伴有嚴重腎損害及高風險心血管疾病，由腎小球、腎小管和間質(zhì)的改變和慢性炎癥反應組成[2]。雖然嚴格的血糖和血壓控制可以延緩DN的發(fā)生，但并不能完全阻止疾病的進展[3]。因此，尋找DN新的、潛在的治療靶點和治療方法，一直是臨床醫(yī)師面臨的重大挑戰(zhàn)，也是國內(nèi)外的研究熱點。

近年來，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)已經(jīng)在醫(yī)療界被認為是治療DN有前景的組織再生方法[4]。間充質(zhì)干細胞可減緩糖尿病動物腎臟細胞損傷，改善微量白蛋白和腎臟病理改變[5]。對DN修復和再生多年的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植后通過三種作用模式發(fā)揮作用，包括直接修復腎細胞損傷，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應，以及抗纖維化(圖1)。除了再生和分化的潛能外，MSCs的旁分泌功能越來越受到關注，其旁分泌多種營養(yǎng)因子通過調(diào)節(jié)鄰近細胞來發(fā)揮生物學功能，如免疫調(diào)節(jié)和抗凋亡[6]，其中最重要的是MSCs來源的細胞外囊泡，主要包括外泌體(exosomes，exo)和微囊泡[7](圖2)。 在本文中，將對間充質(zhì)干細胞在DN中的治療潛力，主要為MSC旁分泌的營養(yǎng)因子和細胞外囊泡外泌體的作用機制進行了綜述。

圖1 間充質(zhì)干細胞修復糖尿病腎病的作用方式和機制

圖2 間充質(zhì)干細胞旁分泌方式治療糖尿病腎病的機制

MSCs治療糖尿病的機制

修復糖尿病腎臟細胞損傷眾所周知，由腎小球內(nèi)皮細胞，腎小球基膜(GBM)和足細胞構(gòu)成的腎小球濾過屏障在DN的發(fā)病機制中起著重要作用，其是阻止蛋白尿發(fā)生的關鍵屏障。MSCs具有修復腎細胞損傷的作用，進而減少糖尿病動物白蛋白尿和減輕腎小球損傷。并且MSCs可防止體外高糖誘導培養(yǎng)的足細胞的損傷。Zhang等[8]的研究表明，鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠經(jīng)反復靜脈注射MSCs可顯著減輕腎小球肥大及降低尿蛋白排泄。據(jù)報道，人胎胰腺源性間充質(zhì)干細胞可抑制DN大鼠足細胞融合和缺損及GMB增厚，維持腎小球濾過屏障的完整性[9]。此外，在體外移植MSCs的DN大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)升高的腎增殖指數(shù)(Bcl-2、klotho基因等)增高和腎凋亡指數(shù)(Bax等)降低，有效的阻止了腎臟損害[10]。

調(diào)節(jié)炎性和免疫性反應MSCs除了直接促進腎臟損傷的修復外，對調(diào)節(jié)腎臟再生中的炎癥和免疫反應同樣發(fā)揮重要作用[11]。在DN大鼠模型中，MSCs明顯抑制單核細胞來源的樹突狀細胞的分化和巨噬細胞的活化[12]。而且，MSCs通過抑制巨噬細胞浸潤與IL- 6和TNFα等炎癥因子的分泌來發(fā)揮抗炎作用以減緩DN 的進展[13-14]。此外，越來越多的證據(jù)表明，MSCs通過與巨噬細胞、T細胞、NK細胞等免疫細胞直接作用，對機體進行免疫調(diào)節(jié)[13-15]。

改善腎臟纖維化細胞外基質(zhì)的沉積可引起腎臟纖維化，糖尿病腎病中腎臟的纖維化與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中腎細胞表型的促纖維化改變有關[16]。對DN小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs可以顯著改善腎臟纖維化，縮小小鼠腎臟的纖維化區(qū)域，同時，這種變化也反映在促纖維化分子的表達水平上，如Ⅰ型膠原蛋白和纖連蛋白表達明減少[17-18]。Jiang等[9]在其研究中也證明，胎兒胰腺祖細胞可能通過減少纖連蛋白的積累而逆轉(zhuǎn)DN的損傷。

通過旁分泌作用改善DN

間充質(zhì)干細胞分泌營養(yǎng)因子研究證明，MSCs對DN的治療主要通過MSCs旁分泌的各種營養(yǎng)因子發(fā)揮作用，這些因子主要分為三類:生長因子、細胞因子和趨化因子[19]。它們在細胞生長、分化、炎癥、遷移、凋亡和信號轉(zhuǎn)導等多種生物學功能中發(fā)揮重要作用，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)、肝細胞生長因子(HGF)、內(nèi)皮生長因子(EGF) 及膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等。BMP-7作為抗纖維化細胞因子，能夠拮抗轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的表達[20]。而MSCs衍生的BMP-7通過在體外和體內(nèi)抑制TGF-β/Smad信號通路改善糖尿病腎小球纖維化[17]。Lv等[21]發(fā)現(xiàn)MSC來源的HGF通過抑制單核細胞趨化蛋白1的表達(MCP-1)減少巨噬細胞浸潤，進而下調(diào)了糖尿病大鼠腎組織中促炎細胞因子如IL-1β，IL-6及TNF的表達；同時發(fā)現(xiàn)HGF通過抑制TGF-β表達的上調(diào)來減輕腎小球硬化。脂肪源MSCs可分泌EGF抑制體外高糖誘導的足細胞caspase-3的表達而改善足細胞凋亡或損傷[22]。同樣，Zhang等[8]在體外高糖誘導培養(yǎng)的足細胞中發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌的GDNF通過下調(diào)足突調(diào)節(jié)蛋白(synaptopodin)的表達預防高糖對足細胞的損傷[8]。

分泌外泌體MSCs是一種多能分化的成體干細胞，具有分化為不同組織的潛能以及自我更新能力[23]，是治療疾病最常用的細胞類型之一。人們最初認為MSCs是通過遷移到損傷部位，分化成組織再生所需的細胞來發(fā)揮其治療作用[24]，但后來的研究表明MSCs可以經(jīng)旁分泌多種細胞因子來減少細胞損傷，并促進修復。exo作為MSCs旁分泌的一種重要胞外囊泡，能夠改善受損組織功能[25]，靶向調(diào)控組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，使組織細胞能夠修復和再生[26]，是細胞間信息交流的重要信使。

外泌體是直徑為40～150 nm的磷脂雙分子層囊泡,含有豐富的生物活性分子，如mRNA、microRNA及蛋白質(zhì)等成分，來源廣泛，幾乎存在于所有生物體內(nèi)。外泌體膜同細胞膜相似，含有許多信號分子和表面抗原，據(jù)報道其內(nèi)存在蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)但不具有細胞核或線粒體等細胞器[27]。來源于MSCs的外泌體(MSC-exos)主要通過mRNA、微小RNA(microRNA)和蛋白質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用，然后以蛋白質(zhì)為作用基礎通過多種機制改變靶細胞的活性，可以增強與靶細胞間的信息交流，促進細胞的增殖、遷移或抑制細胞的凋亡，從而達到修復組織損傷的目的，是細胞與組織修復的關鍵調(diào)節(jié)因子，因此對腎臟的組織結(jié)構(gòu)具有保護作用[28]。

MSC-exos參與DN治療的機制研究

抑制足細胞凋亡細胞凋亡是DN的一個重要特征，其中足細胞凋亡是最主要的病理變化。足細胞是腎小球臟層細胞，覆蓋在腎臟超濾屏障的外層，與腎小球的功能密切相關。近年來，大量研究表明足細胞損傷是糖尿病的早期病理變化，足細胞消退、脫分化和凋亡是DN足細胞損傷的主要類型[29]。DN患者的慢性高血糖和AGEs的積累不斷刺激系膜細胞內(nèi)TGF-β的分泌和足細胞中TGF-β受體(TGF-βR )的表達，以及ROS介導的p38MAPK和caspase-3的激活協(xié)同促使足細胞凋亡[30]，刺激巨噬細胞活化并釋放多種炎性因子，導致腎組織損傷，使炎癥微環(huán)境和免疫微環(huán)境改變[12,25]。

Jiang等[31]經(jīng)糖尿病大鼠尾靜脈注射尿源性干細胞外泌體(USCs-exo)，觀察到與對照組相比，大鼠尿量和尿微量白蛋白排泄均降低，足細胞和腎小管上皮細胞凋亡減少，腎小球內(nèi)皮細胞增殖。進一步研究發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)變是由MSC-exos抑制caspase-3過表達而實現(xiàn)，而且USCs-exo分泌的分子包括生長因子，TGF-β1，血管生成素和BMP-7等，可抑制足細胞凋亡，促進血管再生和細胞存活預防或緩解DN中發(fā)揮關鍵作用。此研究為MSC-exos治療DN尋找了一個方向。近期有研究發(fā)現(xiàn)，MSC-exos可通過介導miRNA-410、miRNA-495和let-7a的轉(zhuǎn)錄而抑制與細胞凋亡相關的幾種編碼mRNA，以及細胞骨架相關分子如CASP3、SHC1和 SMAD4等的表達，其中SMAD4可編碼TGF-β1的蛋白質(zhì)并介導纖維化的發(fā)生[32]。DN小鼠體內(nèi)移植脂肪源MSCs后尿蛋白、血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)和足細胞凋亡水平均降低；在體外實驗中，MSCs逆轉(zhuǎn)了高糖誘導的MPC5細胞活力的降低和細胞凋亡的增加。研究發(fā)現(xiàn)由MSC-exos包含的miR-486在體外細胞凋亡和體內(nèi)DN癥狀改善過程中起著至關重要的作用。miR-486通過靶向調(diào)節(jié)Smad1降低Smad1表達，進而抑制Smad1/mTOR信號通路的活化，逆轉(zhuǎn)了足細胞凋亡，改善腎小球的高濾過，從而減少蛋白尿生成，發(fā)揮腎保護的功能，延緩DN的發(fā)展[33]。

通過mTOR信號通路增強自噬作用mTOR(雷帕霉素靶蛋白)存在兩個獨立的信號復合物，mTOR復合物1 (mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)，二者共同調(diào)節(jié)自噬活性[34]。m TORC1主要是促進細胞的生長與增殖的作用，m TORC2則主要是調(diào)節(jié)細胞的極性、細胞骨架蛋白和肌動蛋白。自噬作用是通過溶酶體來降解消除細胞毒性蛋白聚集物和受損的細胞器，使細胞回收線粒體能源并存活，在維持生物體正常功能以及抵御外界刺激中發(fā)揮著重要作用，是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要途徑，也是腎臟維持正常功能的重要途經(jīng)。LC3是自噬體的常見指示蛋白，自噬作用一旦被下調(diào)，LC3 II/LC3 I的表達隨即被抑制，進而參與到足細胞凋亡的過程中加重DN[34]。

足細胞和腎小管細胞的自噬功能受損，導致腎小球的濾過及腎小管的重吸收出現(xiàn)障礙，這與DN的發(fā)生密切相關。DN患者體內(nèi)mTOR由于高血糖刺激而處于過度激活狀態(tài)，抑制細胞自噬，導致足細胞受損，從而促使系膜外基質(zhì)沉積及蛋白尿出現(xiàn)[34]。Ebrahim等[34]將實驗大鼠分為五組，即對照組、DN、外泌體處理DN、用3-甲基和氯喹(自噬抑制劑)處理DN、用3-甲基和氯喹及外泌體處理DN，處理組經(jīng)尾靜脈注射給藥后觀察首次發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠腎臟中，骨髓MSC-exos可通過mTOR信號通路在體內(nèi)調(diào)節(jié)自噬來改善DN，表現(xiàn)為mTOR和纖維化標志物表達顯著降低，從而減少蛋白尿、抑制纖維化。脂肪MSC-exos能夠提高miR-486的表達，通過下調(diào)靶基因Smad1的表達，抑制Smad1/mTOR的激活，從而增強自噬，減少足細胞凋亡，改善DN[33]。

小結(jié)：MSCs作為DN治療策略被越來越多研究者關注。對MSCs作用途徑的研究更多聚焦于其旁分泌機制對DN發(fā)揮治療作用，由MSCs旁分泌的分子如營養(yǎng)因子和囊泡介導和調(diào)節(jié)DN的病理生理學變化，包括氧化應激，ECM重塑，細胞凋亡和增殖，以及免疫應答和炎性反應。特別是MSC-exos這種治療方法，因其多效性、安全性等優(yōu)勢，成為DN的候選治療方法，有望給DN患者帶來實質(zhì)性的好處。雖然該技術尚未成熟，但是具有巨大的臨床應用價值。