陳文娟　吳以龍　丁其歡　毛林江　沈曉靜　李興玉　字成庭

摘要? 采用不同乙醇提取時間，DMSO共沸收集-冷凍干燥制備咖啡因的方法，并用高效液相色譜檢測、分析純度。研究表明，95%乙醇提取3 h，DMSO共沸收集-冷凍干燥制備的咖啡因經(jīng)高效液相色譜分析，純度較高。用冷凍干燥方法制得咖啡因的最佳條件為10 g茶葉粉末，95%乙醇75 mL，提取時間2 h，DMSO共沸收集，冷凍干燥。

關(guān)鍵詞? 茶葉;咖啡因;提取;高效液相色譜

中圖分類號? TQ914.1??? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0174-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.052

Method for the Extraction of Caffeine from Tea

CHEN Wen-juan1，WU Yi-long1，DING Qi-huan2 et al? （1.College of Science，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201;2.College of Tea（Puer），West Yunnan University of Applied sciences，Puer，Yunnan 665000）

Abstract? In this study，DMSO azeotropic collection and freeze-drying were used to prepare caffeine in different ethanol extraction times，and the purity was detected and analyzed by HPLC.The research showed that the caffeine extracted by 95% ethanol for 3 h，DMSO azeotropic collection and freeze-drying was characterized with high purity by high performance liquid chromatography（HPLC）.We confirmed that the best condition for the preparation of caffeine by freeze-drying method was 10 g tea powder，75 mL 95% ethanol，3 h extraction time，DMSO dissolution and freeze-drying.

Key words? Tea;Caffeine;Extraction; HPLC

基金項目? 國家自然科學基金青年基金項目（21602196）;云南省自然科學基金青年基金項目（2017FD084）;云南省農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項面上項目（2017FG001〔-046〕）;云南農(nóng)業(yè)大學青年自然科學基金青年基金項目（2015ZR08）。

作者簡介? 陳文娟（1996—），女，白族，云南大理人，從事茶葉研究與開發(fā)工作。*通信作者，李興玉，博士，從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)工作;字成庭，博士，從事化學生物學研究。

收稿日期? 2019-03-18

茶樹是一種很古老的雙子葉植物，茶葉主產(chǎn)于我國西南、華南、江南、江北等地區(qū)，有野生和栽培品種，資源相對充足。近年來對于茶葉中生物堿活性的研究不斷有新的發(fā)現(xiàn)。茶葉中含有多種生物堿，咖啡堿是其中之一。

咖啡堿又稱為咖啡因，咖啡因含量占茶葉干物質(zhì)總量的2%～5%，其化學名稱為1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤[1-2]。咖啡因分子式為C8H10N4O2，分子量是194.19?？Х纫虻娜埸c在238 ℃，能溶于氯仿、丙酮、乙醇和水[3]?？Х纫蚓哂锌顾ダ稀⒗?、強心、興奮中樞神經(jīng)等藥理和生理作用[4]，應用前景廣泛。利用茶葉原料提取咖啡因具有原料易得、環(huán)保等優(yōu)點，

目前，從茶葉中提取咖啡因的方法主要有水提法、醇提法、有機溶劑提取法、升華法等[1]。但現(xiàn)有提取咖啡因方法因方法具有能耗大、產(chǎn)品收率低、產(chǎn)品純度低等缺點[5]。如何方便、高效地從茶葉中提取咖啡因引起了人們的普遍關(guān)注。筆者采用不同乙醇提取時間，DMSO共沸收集咖啡因與DMSO的混合液，再用冷凍干燥制備咖啡因的方法，并用高效液相色譜檢測、分析純度，探討在不同時間乙醇提取下，用DMSO共沸收集-冷凍干燥制備咖啡因的產(chǎn)率，分析所得咖啡因的純度，在以往試驗方法基礎(chǔ)上提出一些改進，以達到更好的試驗結(jié)果。

1? 材料與方法

1.1? 材料

燒杯、恒溫水浴鍋、100 mL單口圓底燒瓶、磁力攪拌子、油浴鍋、25 mL圓底燒瓶、分析天平、Agilent 1260 高效液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、減壓蒸餾裝置、真空泵、數(shù)字顯示熔點儀等;茶葉、95%無水乙醇、DMSO、甲醇（分析純）、三氟乙酸、蒸餾水、咖啡因標準品。

1.2? 方法

1.2.1? 茶葉粉末的制備。

將曬干的干燥茶葉置于粉碎機內(nèi)粉碎，放入烘箱內(nèi)烘至恒重，取出后冷卻至室溫，得到茶葉粉末，放入燒杯中備用。

1.2.2? 咖啡因的提取。

分別稱取3份5 g的茶葉粉末，置于100 mL的單口圓底燒瓶中，加入75 mL 95%無水乙醇，分別編號為1、2、3。再放入85 ℃恒溫水浴鍋中，接上冷凝裝置，連續(xù)提取1、2、3 h，完成后，微冷抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干回收。將得到的濃縮物用DMSO溶解，加入攪拌子，放在油浴鍋中進行蒸餾，得到含有DMSO和咖啡因的混合液，收集混合液，冷凍干燥，收集所得到的咖啡因并稱重。

1.2.3? 薄層色譜層析試驗。分別取1 mg/mL的3份樣品和咖啡因標準品，用毛細管點樣于10 cm×20 cm的薄層色譜（TLC）薄層板上，點樣動作必須緩慢，每點一滴，需用吹風機吹干后方可再點樣，使得點樣面積控制在3～4 mm范圍內(nèi);將預先配好的展開劑（石油醚∶乙酸乙酯=9∶1）倒入層析槽中，然后蓋上玻璃蓋，讓其層析、展開;將層析后的TLC板取出，吹干后用波長為254 nm的紫外燈顯色。

1.2.4? 高效液相色譜檢測條件。

Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相A（甲醇）-B（水）梯度洗脫（0～10 min，10%A∶50%A，10～20 min，50%A∶70%A，20～30 min，70%A∶90%A）;流速1 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量5 μL;檢測波長280 nm。

1.2.5? 標準品溶液的制備。

精密稱取咖啡因標準品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加少量甲醇超聲溶解，并稀釋定容至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的標準品儲備液。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 標準曲線繪制

取適量咖啡因標準品儲備液置于HPLC進樣瓶中，分別以進樣量0.5、1、3、5、7 μL，按上述設(shè)定的色譜條件測定，得到峰面積值。以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標繪制標準曲線（圖1），計算回歸方程，得到標準曲線回歸方程：Y=0.040 5X+0.716 8（R2=0.999 7）。

2.2? 提取時間對咖啡因產(chǎn)率的影響

根據(jù)上述試驗方法，從茶葉中提取咖啡因的產(chǎn)率和提取時間如表1所示。隨著提取時間的增加，咖啡因提取率并沒有提高。所以，3 h是最佳的提取時間。

2.3? 薄層色譜法檢測對比分析

將干燥得到的咖啡因樣品與標準品在10 cm×20 cm的薄層色譜（TLC）薄層板上，用毛細管點樣，每塊板上點3個樣品（1，2，3）和標準品，用展開劑展開后再用波長為254 nm的紫外燈顯色，得到薄層色譜檢測分析結(jié)果。從圖2可以看出，Rf標準品=Rf樣品1=Rf樣品2=Rf樣品3=0.8，結(jié)果表明制取的咖啡因樣品與標準品一致。

2.4? 高效液相色譜檢測對比分析

將干燥得到的咖啡因樣品與標準品用高效液相色譜對比分析，結(jié)果如表2所示，可以看出咖啡因樣品的純度較高，其中樣品3的純度最接近標準品。圖3是濃度為1 mg/mL咖啡因標準品和樣品溶液的色譜圖，可以看出3組樣品1（t=10.989 min）、2（t=11.072 min）和3（t=10.972 min）的出峰時間與咖啡因標準品（t=10.933 min）出峰時間基本相同。結(jié)果表明，所制備的咖啡因具有較高的純度。

2.5? 熔點測定分析

將制備得到的咖啡因樣品經(jīng)數(shù)字顯示顯微熔點測定儀檢測其熔點，并與咖啡因標準品對照，結(jié)果如表3所示。制取樣品熔點與咖啡因標準品熔點相差0～2 ℃，表明制取的咖啡因樣品符合GB 14758—2010《食品安全國家標準食品添加劑 咖啡因》，說明該研究提取的咖啡因為合格產(chǎn)品。

3? 討論與結(jié)論

3.1? 討論

3.1.1? 咖啡因提取方法的選擇。不同品種的茶葉具有不同的提取條件，如何做到從茶葉中提取出更多、更純的咖啡因是一個值得研究的問題[6-8]。盛貽林等[1]對咖啡因的提取方法進行了對比，主要方法有醇提法、水提法、有機溶劑提取法，但多數(shù)提取方法最后都要用升華來得到咖啡因，而升華法對物質(zhì)本身的溫度要求較高，因此有一定的局限性。該研究浸提茶葉時不再使用索式提取器，直接接上冷凝管，在恒溫水浴鍋中回流，冷凍干燥法代替升華法，簡化試驗操作步驟，應用于咖啡因的提取中，具有短時、高效、環(huán)保等優(yōu)點，同時得到純度較高的咖啡因，提高咖啡因產(chǎn)量，符合綠色環(huán)保理念。張勇等[3]研究了5種咖啡因的提取方法，其中3種都是升華法得到咖啡因，操作步驟較繁瑣，對溫度要求較高。采用冷凍干燥法可以簡化操作步驟，縮短時間，得到純度較高的咖啡因。

3.1.2? 咖啡因提取溶劑的選擇。

咖啡因能溶于水、二氯甲烷、氯仿、乙醇、丙酮等多種溶劑?？Х纫蛱崛》椒ㄓ泻芏喾N，選擇的提取溶劑也有多種?？Х纫蛱崛撨x擇操作步驟簡單、試劑毒性小、儀器要求低、綠色安全的方法。氯仿等有機溶劑有毒、易燃、易揮發(fā)，價格比較高昂，操作不便，一般不選用[3，9]。曾有研究表明有人用丙酮提取咖啡因，得到的咖啡因產(chǎn)率比較高，純度也較高[10]，但是丙酮有毒，對人傷害較大，不符合綠色理念和可持續(xù)發(fā)展的理論;水是提取咖啡因較好的溶劑，水提法對儀器要求低，操作步驟簡單，時間短，并且經(jīng)濟、高效、環(huán)保，但提取產(chǎn)率比較低，咖啡因純度不高;用乙醇作溶劑，無毒性，提取產(chǎn)率高。從安全、環(huán)保的角度出發(fā)，該研究選用95%乙醇水溶液作為提取咖啡因的溶劑。

3.1.3? 咖啡因檢測方法的選擇。

咖啡因的檢測方法有多種，常見的檢測方法有紅外光譜法、高效液相色譜法、氣象色譜法、紫外可見分光光度計測吸光度法等。紅外光譜法具有特征性強、測定快速、分析靈敏度高等特點，但是其對試樣純度要求較高，而且定量分析誤差較大;高效液相色譜法具有分離效能高、靈敏度高、應用范圍廣、分析速度快、載液流速快等優(yōu)點[9-13]，此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點。該研究采用高效液相色譜法來檢測咖啡因。

該研究采用的方法：①縮短回流時間，以往試驗要求回流時間達4～6 h，但根據(jù)實際情況，一般在2～3 h即可;②不再采用升華的方法，而采取冷凍干燥的方法得到咖啡因，簡化操作步驟，更容易得到咖啡因;③用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾裝置來回收乙醇，不僅縮短了蒸餾時間，還提高了溶劑的回收利用率;④較其他有機溶劑提取法，該試驗方法所用溶劑毒性低，對環(huán)境友好。

3.2? 結(jié)論

該研究不再采用索式提取器，將升華法改成直接冷凍干燥，得到咖啡因最佳的提取條件為10 g茶葉粉末，95%無水乙醇75 mL，提取時間2 h，DMSO共沸收集，冷凍干燥。試驗效果明顯，為今后的咖啡因提取提供了一定的指導作用。

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