沈建中，姚遠(yuǎn)，劉大偉

國(guó)家心血管疾病中心發(fā)布的我國(guó)心血管病患病數(shù)據(jù)顯示，目前心血管病死亡占居民疾病死亡構(gòu)成40%以上，居首位，高于腫瘤及其他疾病[1]。活性氧（ROS）被認(rèn)為在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。在正常生理?xiàng)l件下，人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生少量ROS，當(dāng)受到外界環(huán)境刺激后體內(nèi)ROS的產(chǎn)生會(huì)急劇增加[2]。ROS包括超氧陰離子、脂質(zhì)自由基等自由基及過(guò)氧化氫（H2O2）、次氯酸等非自由基，這些ROS會(huì)造成體內(nèi)過(guò)強(qiáng)的氧化作用而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。大量ROS的累積會(huì)引起氧化壓力促進(jìn)心血管疾病的發(fā)展，因此抑制或清除ROS的產(chǎn)生來(lái)阻礙內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷被認(rèn)為是預(yù)防心血管疾病的有效策略。

原花青素（PB2）是一種黃酮類化合物，常見(jiàn)于各種水果、可可及紅葡萄酒中。研究指出，適量飲用紅葡萄酒，具有降低罹患冠狀動(dòng)脈心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)，被認(rèn)為可能與PB2的作用有關(guān)[3]。另外，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，PB2可具有抗炎及抗氧化的功效[4]。然而，目前對(duì)于PB2保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的效果及可能機(jī)制的研究尚少。因此，本研究以H2O2誘發(fā)人類內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926氧化損傷作為研究模式，探討PB2對(duì)于DNA氧化損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與材料人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。H2O2、PB2、α-生育酚（α-tocopherol）購(gòu)買于Sigma公司。加強(qiáng)型小牛血清（CCS）購(gòu)買于Hyclone公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與藥物處理取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入DMEM培養(yǎng)液（含10%CCS、NaHCO3、青/鏈霉素），在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度約八分滿時(shí)，以1倍trypsin-EDTA進(jìn)行消化，再以2×105/ml的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞隨機(jī)分為5組，分別給予不同處理。對(duì)照組僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液處理；H2O2組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用H2O2，終濃度為200 μmol/L；α-生育酚組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用H2O2及α-生育酚（α-tocopherol），終濃度分別為200 μmol/L 及30 μmol/L；2 μM PB2組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用H2O2及PB2，終濃度分別為200 μmol/L及2 μmol/L；10 μM PB2組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用H2O2及PB2，終濃度分別為200 μmol/L及10 μmol/L。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)分析將經(jīng)過(guò)各種藥物處理的細(xì)胞，移除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入500 μl 1倍trypsin-EDTA混合均勻后待細(xì)胞脫落，再加入1.5 ml培養(yǎng)液，取100 μl細(xì)胞懸浮液并加入100 μl 0.4% trypan blue混合后，取10 μl置入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 活性氧測(cè)定將濃度為2×105/ml EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，待貼盤后以PBS清洗2次，再分別加入α-生育酚（終濃度30 μmol/L）及PB2 （終濃度為別為2 μmol/L及10 μmol/L）培養(yǎng)24 h，接著以含有H2O2（濃度為200 μmol/L）無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液及DCFH2DA（終濃度10 μmol/L），避光培養(yǎng)30 min，將培養(yǎng)基移除，并以PBS清洗2次，加入200 μl TE將細(xì)胞取下，并懸浮于PBS中，1000 g離心5 min，棄上清，再加入PBS混勻并過(guò)濾后做流式細(xì)胞儀分析。

1.5 脂質(zhì)過(guò)氧化物活性TBARS比色法定量測(cè)定各組取細(xì)胞上清液1 ml與二丁基羥基甲苯混合均勻（終濃度為0.5 mM），并加入2.5% TCA與0.7%TBA后，以100℃水浴加熱10 min。待樣品冷卻后加入3 ml丁醇并離心（1000 g，5 min），取1 ml樣品以熒光分光亮度計(jì)（CT2200，ChromTech，Germany）測(cè)定，波長(zhǎng)為excitation：515 nm及emission：555 nm，分析MDA含量，判斷脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。

1.6 微凝膠電泳測(cè)定DNA損傷首先配置含有1%NMA和1% LMA的膠體溶液。將150 μl NMA加至磨砂玻片上，蓋上蓋玻片后，移至冰盒上冰浴5 min，再將蓋玻片移除。制備第2層膠，取500 μl LMA與細(xì)胞懸浮液混合均勻，取150 μl含有細(xì)胞的LMA至磨砂玻片上，冰浴10 min，待凝膠后，放置室溫使玻片回溫，再滑開(kāi)蓋玻片準(zhǔn)備制備第3層膠。第3層膠，取150 μl NMA加到磨砂玻片，蓋上蓋玻片放到冰盒，冰浴10 min。取下蓋玻片，將磨砂玻片放到事先裝有裂解緩沖液（Lysis Buffer；2.5 M NaCl，100 mM Na2EDTA，10 mM tris，1% N-sodium lauroyl sarcosinate，1%triton X-100，10% DMSO）的染色壺中，放到4℃冰箱1 h后，事先將電泳液（300 mM NaOH+1 mM Na2EDTA）倒進(jìn)電泳槽，約200 ml，再將染色壺中的磨砂玻片以2次水過(guò)水，清洗，整齊排列于電泳槽，浸漬15 min。以電泳條件300 mA、20 min進(jìn)行電泳。接著將0.4 M tris buffer（pH 7.4）倒入染色壺，取出電泳槽里的磨砂玻片，以去離子水過(guò)水清洗，放入染色壺中，浸泡10 min。拿出玻片，以去離子清洗后放到玻片保存盒，觀察時(shí)取200 μl細(xì)胞懸浮液（加入20 μg/ml EB染色）于熒光顯微鏡下觀察，并以軟件Image Pro Plus 5.0定量其DNA傷害程度。DNA傷害程度以TMOM表示，即：TMOM=TDNA（DNA拖尾百分比）×TDx（拖尾長(zhǎng)度）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果均經(jīng)3次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，并使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，再以新復(fù)極差法比較組與組間平均值差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較與對(duì)照組比較，H2O2處理組的細(xì)胞數(shù)目明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H2O2組相比，α-生育酚處理組、2 μM和10 μM PB2處理組的細(xì)胞數(shù)目均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（圖1）。

圖1 不同處理組人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較

2.2 PB2對(duì)H2O2誘發(fā)人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷的影響與對(duì)照組比較，H2O2處理組細(xì)胞DNA損傷明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H2O2組對(duì)比，α-生育酚處理組、2 μM和10 μM PB2處理組對(duì)H2O2所誘發(fā)的DNA損傷明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），抑制率分別為95%、24%和55%。其中，α-生育酚處理組、2 μM和10 μM PB2處理組三組間的抑制率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 PB2對(duì)H2O2誘發(fā)人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的影響與對(duì)照組比較，H2O2處理組的MDA水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與H2O2處理組對(duì)比，α-生育酚處理組、2 μM和10 μM PB2處理組明顯抑制H2O2誘發(fā)人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞MDA的產(chǎn)生，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），抑制率分別為49%、21%和42%。其中，2 μM PB2處理組的抑制率低于α-生育酚處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而10 μM PB2處理組與α-生育酚處理組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4 PB2對(duì)H2O2誘發(fā)人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞ROS的影響與對(duì)照組比較，H2O2處理組的ROS水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與H2O2處理組對(duì)比，α-生育酚處理組、2 μM和10 μM PB2處理組明顯抑制H2O2誘發(fā)人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），抑制率分別為80%、18%和41%。其中，α-生育酚處理組、2 μM和10 μM PB2處理組三組間的抑制率兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（圖4）。

圖2 不同處理組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷情況比較

圖3 不同處理組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化情況比較

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在心血管疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。研究表明，幾乎所有已知的導(dǎo)致心血管疾病的危險(xiǎn)因素均直接或間接通過(guò)損傷內(nèi)皮細(xì)胞而導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生、發(fā)展[5]。活性氧（ROS）是引起心血管疾病的重要因子之一，H2O2在過(guò)氧化條件下會(huì)分解出氧自由基，可導(dǎo)致機(jī)體生物膜中多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化而造成細(xì)胞損傷[6,7]。丙二醛（MDA）為脂質(zhì)過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物，可作為判斷脂質(zhì)過(guò)氧化的重要指標(biāo)[8]。體內(nèi)ROS和MDA產(chǎn)生增多均會(huì)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。尋找抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物己成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[9]。α-生育酚是人體從飲食中攝取的重要抗氧化劑之一，主要分布于血液、細(xì)胞和組織中。許多研究均證實(shí)，α-生育酚對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷具有良好的保護(hù)效果[10]。因此，在本研究以α-生育酚作為陽(yáng)性對(duì)照。原花青素B2（PB2）是一類特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，具有極強(qiáng)的抗氧化、消除自由基的作用。流行病學(xué)及動(dòng)物試驗(yàn)均顯示，富含黃酮類的飲食可以降低心腦血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[11,12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，200 μM H2O2可明顯引起內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，因此，本研究選用目前公認(rèn)的可用于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞株EA.hy926，以200 μM H2O2干預(yù)制作氧化應(yīng)激損傷模型，觀察PB2抑制H2O2誘發(fā)人類內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的效果及其可能機(jī)制。

圖3 PB2對(duì)于H2O2誘發(fā)人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞ROS的影響

研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，H2O2處理組的細(xì)胞數(shù)目明顯降低（P＜0.05）；與H2O2組相比，α-生育酚處理組、2 μM和10 μM PB2處理組的細(xì)胞數(shù)目均明顯增加（P均＜0.05）。ROS誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化是動(dòng)脈粥狀硬化的關(guān)鍵因素之一，尤其是對(duì)于生物膜的損傷，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性與通透性產(chǎn)生變化并引發(fā)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的缺損[13-15]，此外，ROS還會(huì)攻擊細(xì)胞中DNA，造成DNA斷裂[7]。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA會(huì)和人體內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等分子形成交錯(cuò)連接，造成細(xì)胞組織氧化損傷[16]。與既往研究結(jié)果一致，本研究中，與對(duì)照組比較，H2O2處理組的細(xì)胞DNA損傷顯著（P＜0.05），MDA水平亦明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；而與H2O2處理組相比較，2 μmol/L和10 μmol/L劑量PB2處理組、α-生育酚處理組對(duì)H2O2所誘發(fā)的DNA損傷明顯抑制（P＜0.05）且MDA的產(chǎn)生較H2O2處理組明顯減少（P＜0.05）。Raudone等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PB2是蘋果中清除ROS的主要酚類化合物。另外，Yang等[18]研究也指出，在HUVEC細(xì)胞中，PB2可以降低脂多糖所誘發(fā)的ROS含量。因此，本研究進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀測(cè)定PB2對(duì)細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，H2O2處理組的ROS水平顯著上升（P＜0.05）。與H2O2處理組相比較，2 μmol/L和10 μmol/L PB2處理組、α-生育酚處理組均明顯抑制H2O2誘發(fā)人類EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生（P＜0.05），抑制率分別為80%、18%和41%。

綜上所述，PB2可顯著抑制200 μM H2O2對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞的DNA損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化作用，其可能機(jī)制是通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)ROS而達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的效果。但本研究尚處于初級(jí)研究階段，許多具體的作用機(jī)制尚不清楚，如未考慮PB2是否由增加體內(nèi)抗氧化酵素的活性而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，在后續(xù)的相關(guān)研究中還需進(jìn)一步深入探究。