李付鵬 伍寶朵 秦曉威 閆林 賴劍雄

摘 ?要 ?本研究以收集保存的38份可可種質(zhì)資源為對象，在2016年1月極端低溫期間，進(jìn)行抗寒性初步評價，依據(jù)低溫危害后可可果實和葉片損害程度，可可資源抗寒性可分成5級。以具有抗寒性差異的INA-t5（Ⅰ級）、COM-e8（Ⅱ級）、ECU-ev6（Ⅳ級）、THA-o6（V級）種質(zhì)為材料，研究抗寒性差異種質(zhì)在4 ℃脅迫條件下植株的傷害情況、葉片解剖結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)變化。結(jié)果表明：低溫脅迫條件下，INA-t5、COM-e8種質(zhì)比THA-o6、ECU-ev6種質(zhì)具有明顯的耐寒表型，可可葉片受害程度差異顯著;可可的丙二醛和脯氨酸含量的變化幅度與其抗寒性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān);脅迫48 h 后，THA-o6、ECU-ev6種質(zhì)保護(hù)酶系統(tǒng)逐漸被破壞，INA-t5、COM-e8種質(zhì)則仍然表現(xiàn)活躍。綜合以上結(jié)果，INA-t5、COM-e8為抗寒性種質(zhì)，其抗寒性比THA-o6、ECU-ev6強(qiáng)，抗氧化酶活性和滲透物質(zhì)含量變化規(guī)律以及差異種質(zhì)，可為可可開展抗寒育種和抗寒分子機(jī)理研究提供理論和材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ?可可種質(zhì);鑒定評價;抗寒性;酶活性

中圖分類號 ?S571.3 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?During the extreme low temperature period of January 2016， cold resistance of 38 cacao germplasms were evaluated in Wanning， Hainan. According to the damage degree of cacao pods and leaves after low temperature， five grades were distinguished among the cacao germplasms. Using the selected cold resistance difference germplasms INA-t5 （grade Ⅰ）， COM-e8 （grade Ⅱ）， ECU-ev6 （grade Ⅳ） and THA-o6 （grade V）， leaves anatomy and physiological responses of the cacao plants were studied after 4 ℃ low temperature treatment. Under low temperature stress， INA-t5 and COM-e8 showed obvious cold-tolerance over THA-o6 and ECU-ev6， and the damage degree of the leaves was significant. It was negatively correlated between cold resistance and malondialdehyde， proline content in cacao leaves. The protective enzyme systems of THA-o6 and ECU-ev6 were gradually destroyed in low temperature stress for 48 h， while the enzyme system of INA-t5 and COM-e8 were still active. It meant that the cold resistance of INA-t5 and COM-e8 was stronger than that of THA-o6 and ECU-ev6. The antioxidant enzyme activity， osmotic substances content and cold-resistance difference germplasm could be used for cold-resistant breeding and molecular mechanism investigation.

Keywords ?cacao germplasm; identification and evaluation; cold resistance; enzyme activity

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.006

可可（Theobroma cacao L.）屬于梧桐科可可屬常綠小喬木，種子（可可豆）富含脂肪、蛋白、多酚等成分，味醇香，是制作巧克力、飲料等的主要原料?？煽稍a(chǎn)南美熱帶雨林下，是典型的熱帶作物，現(xiàn)已廣泛分布于世界熱帶地區(qū)的60多個國家，直接從業(yè)者超過4000多萬人[1]。據(jù)國際可可組織（ICCO）統(tǒng)計，2016和2017年收獲季世界可可收獲面積約1000萬hm2，總產(chǎn)量470萬t，為世界第二大飲料作物[2-3]。我國可可主要種植在海南、云南，國內(nèi)生產(chǎn)的可可豆遠(yuǎn)不能滿足市場需求，目前我國所需可可豆基本依賴進(jìn)口，2017年我國可可豆及制品進(jìn)口量為12萬t，且每年以較快的增長率持續(xù)遞增。歐美等發(fā)達(dá)國家人均巧克力年消費在10 kg以上，即使在亞洲，東亞大多數(shù)國家的人均年消費也在2 kg以上，而目前我國還不足50 g[4-5]。隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，可可消費量還將大幅增加，市場缺口不斷擴(kuò)大。

我國可可主要分布在海南、云南、廣東、臺灣等省區(qū)，其中海南是可可主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量均占全國90%以上[6]。我國海南地處熱帶邊緣，可可主產(chǎn)區(qū)冬季常有低溫危害，主栽品種熱引4號可可受寒后易出現(xiàn)落葉、落果、枯枝等現(xiàn)象，且傷口極易感染黑果病等病害，易給種植戶造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7]。低溫成為影響我國可可豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和制約可可產(chǎn)業(yè)北擴(kuò)的重要因素。因此開展可可種質(zhì)資源抗寒性鑒定，篩選和培育抗性種質(zhì)（品種）是我國可可育種的重要目標(biāo)。

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所從20世紀(jì)60年代開始，從東南亞、非洲、拉丁美洲等可可主產(chǎn)區(qū)收集3大類可可遺傳資源300多份，含有許多具有經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力的優(yōu)異資源，為可可品種選育和改良提供了重要材料來源[8]。然而，關(guān)于可可種質(zhì)資源抗寒性鑒定，低溫脅迫對可可幼苗生理生化的影響仍未見報道。本研究利用極端低溫天氣對收集保存的可可種質(zhì)資源進(jìn)行抗寒性鑒定，篩選抗寒性強(qiáng)的可可種質(zhì)，并對篩選出的抗寒性差異種質(zhì)開展葉片生理生化和顯微結(jié)構(gòu)變化研究，為進(jìn)一步研究可可抗寒機(jī)理提供依據(jù)，并為可可抗寒育種研究提供優(yōu)異材料資源。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶香料飲料作物種質(zhì)資源圃的38份可可資源，厄瓜多爾8份（ECU-）、巴新1份（PNG-）、印尼6份（INA-）、科摩羅2份（COM-）、越南4份（VN-）、泰國5份（THA-）、名稱中有“SBRI-”的12份種質(zhì)為在引進(jìn)種質(zhì)基礎(chǔ)上雜交創(chuàng)制的資源，詳見表1。

1.2 ?方法

1.2.1 ?成齡可可樹抗寒性田間調(diào)查 ?2016年1月23日極端低溫后，田間調(diào)查38份可可資源材料的抗寒性，為便于比較分析，將可可抗寒性程度分成5級，標(biāo)準(zhǔn)如下：

Ⅰ級：果實生長正常，≤10%成熟葉片葉色黃色;Ⅱ級：1/8果實表面顏色出現(xiàn)黑色果實比例> 30%（果實寒害1級），成熟葉片葉色黃色比例> 10%、≤30%;Ⅲ級：1/4果實表面顏色出現(xiàn)黑色果實比例>30%（果實寒害2級），成熟葉片葉色黃色比例>30%、≤50%;Ⅳ級：1/2果實表面顏色出現(xiàn)黑色果實比例>30%（果實寒害3級），成熟葉片葉色黃色比例>50%、≤70%;Ⅴ級：3/4果實表面顏色出現(xiàn)黑色果實比例>30%（果實寒害4級），成熟葉片葉色黃色比例>70%。

1.2.2 ?可可幼苗低溫脅迫處理 ?篩選抗寒性差異的8份可可種質(zhì)，分別繁育袋裝苗，選取無病蟲害、長勢良好、生長一致的可可袋裝苗在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理，試驗溫度處理設(shè)置為4 ℃，試驗對照溫度設(shè)置為30 ℃/28 ℃，光周期設(shè)置為12 h/12 h，相對濕度保持在70%左右。低溫脅迫0、24、48、72、96 h時，分別剪取葉片并迅速置于液氮中冷凍，–80 ℃保存，用于后續(xù)測定葉片生理生化指標(biāo)變化;剪取第一穩(wěn)定葉，并用FAA固定液處理后，制作石蠟切片觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)，每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 ?生理指標(biāo)測定 ?可可生理生化指標(biāo)采用江蘇科銘生物技術(shù)有限公司測定試劑盒，參照試劑盒操作說明進(jìn)行測定INA-t5、COM-e8、ECU-ev6、THA-o6 4份可可種質(zhì)幼苗葉片的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量（Pro）、丙二醛含

量（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）酶活性等生理生化指標(biāo)。從無病害、成熟葉中部剪取樣品，大小為5 mm×5 mm，將樣品置于FAA固定液處理72 h，經(jīng)石蠟切片機(jī)切片、染色后，置于Olympus BX51正置熒光顯微鏡下觀察拍照，比較各樣品柵欄組織和海綿組織結(jié)構(gòu)變化。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

觀測數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的均值，用Excel軟件處理分析數(shù)據(jù)，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，分別在0.05和0.01水平比較差異顯著性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同可可種質(zhì)抗寒性表現(xiàn)

2016年1月，海南萬寧興隆地區(qū)極端低溫達(dá)7 ℃條件下，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶香料飲料作物種質(zhì)資源圃的38份可可種質(zhì)葉片、果實凍害率及綜合抗寒等級見表1，果實受寒害后表現(xiàn)如圖1。由表1看出，供試材料的抗寒性分為5級，從強(qiáng)到弱分別包含3、22、10、2、1份種質(zhì)，耐寒與極不

耐寒種質(zhì)份數(shù)均呈現(xiàn)低比例趨勢。其中VN-sv6、INA-t5種質(zhì)田間抗寒性最強(qiáng)，葉片受害率分別為15.9%、15.6%，1級抗寒等級果實比例分別為9.1%、9.8%。THA-o6種質(zhì)田間抗寒性最弱，葉片受害率為70.5%，4級抗寒等級果實比例為62.2%。此外，COM-e8種質(zhì)葉片受害率為33.8%，1級抗寒等級果實比例為33.6%;ECU-ev6種質(zhì)葉片受害率為59.7%，3級抗寒等級果實比例為36.9%。

2.2 ?低溫脅迫對可可葉片結(jié)構(gòu)影響

4 ℃低溫脅迫處理后，可可種質(zhì)INA-t5、THA-o6葉片表型及顯微結(jié)構(gòu)變化見圖2和圖3。結(jié)果表明，隨著低溫脅迫時間延長，THA-o6葉片的葉脈及附近組織逐漸褐化，脅迫24 h主葉脈開始出現(xiàn)褐化，脅迫48 h主葉脈和支葉脈褐化，脅迫72 h主葉脈和支葉脈全部褐化并向附近組織擴(kuò)散，脅迫96 h主葉脈和支葉脈全部褐化，葉脈間大部分葉肉組織褐化并出現(xiàn)失水現(xiàn)象。INA-t5葉片在低溫脅迫前期變化不明顯，脅迫96 h主葉脈表現(xiàn)出輕度褐化。THA-o6葉片4 ℃脅迫96 h后，海綿組織細(xì)胞排列紊亂，并且微葉脈細(xì)胞著色較深;INA-t5葉片4 ℃脅迫96 h后變化不明顯，部分微葉脈細(xì)胞著色較深。

2.3 ?低溫脅迫對可可葉片可溶性糖含量、可溶性蛋白影響

4 ℃低溫脅迫后，不同可可種質(zhì)可溶性糖含量、可溶性蛋白隨脅迫時間延長出現(xiàn)顯著變化（圖4）。INA-t5種質(zhì)的可溶性糖含量呈升高趨勢，脅迫96 h時達(dá)到最大值，與相比脅迫0 h相比提高了1.31倍;可溶性蛋白先下降再上升后保持穩(wěn)定，脅迫24 h時達(dá)到最小值，降低到脅迫0 h的0.63倍，脅迫48 h時回升1.37倍，脅迫96 h含量達(dá)到最高，顯著高于其他種質(zhì)。COM-e8種質(zhì)的可溶性糖含量呈先穩(wěn)定再下降后回升變化趨勢，可溶性蛋白呈下降、上升式變化，脅迫72 h時達(dá)到最小值，降低到脅迫0 h的0.43倍，脅迫96 h時回升1.65倍。THA-o6、ECU-ev6可溶性糖含量呈現(xiàn)下降趨勢，脅迫72 h時略有上升;可溶性蛋白呈下降、上升、下降波浪式變化，脅迫24 h時達(dá)到最小值，分別降低到脅迫0 h的0.57、0.47倍，隨后升高后再降低，脅迫96 h時與脅迫0 h相比降低了0.42、0.33倍。脅迫96 h后，抗寒種質(zhì)INA-t5可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著高于其他3份種質(zhì)。說明低溫脅迫后，可可響應(yīng)低溫，提高可溶性糖和可溶性蛋白含量以提高對膜的保護(hù)作用，然而對低溫響應(yīng)能力不強(qiáng)。

2.4 ?低溫脅迫對可可葉片Pro、MDA含量影響

4 ℃低溫脅迫后，不同可可種質(zhì)脯氨酸、丙二醛變化差異較大（圖5）。低溫脅迫后，INA-t5、COM-e8的Pro含量變化不大;ECU-ev6的Pro含量先上升后下降，脅迫24 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了4.57倍，隨后急劇下降脅迫48 h時僅為脅迫24 h時的0.28倍;THA-o6的Pro含量呈上升、下降、上升波浪式變化，脅迫24、48、72 h時，含量分別為脅迫0 h的1.85倍、1.10倍、2.37倍。INA-t5的MDA含量持續(xù)上升，脅迫72 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.65倍;COM-e8的MDA含量先上升后下降，脅迫24 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了1.31倍;THA-o6、ECU-ev6的MDA含量下降后略有回升。4 ℃低溫脅迫后，THA-o6、ECU-ev6的MDA、Pro變化幅度較大，膜脂過氧化程度較高導(dǎo)致抗寒性弱;INA-t5、COM-e8的MDA、Pro含量變幅小，膜脂過氧化程度較低從而抗寒性強(qiáng)。

2.5 ?低溫脅迫對可可葉片POD、CAT、SOD 活性影響

4 ℃低溫脅迫處理對可可POD、CAT、SOD活性的影響見圖6。由圖3可以看出，4 ℃低溫脅迫后，INA-t5 POD酶活性先上升后下降，脅迫24 h時達(dá)到最大值，顯著高于其他3份種質(zhì);THA-o6 POD酶活性變化不明顯，脅迫24 h時達(dá)到最小值，降低到脅迫0 h的0.94倍，隨后少量回升并保持穩(wěn)定，并且顯著低于INA-t5和ECU-ev6種質(zhì)。INA-t5 CAT酶活性呈上升趨勢，脅迫96 h時達(dá)到最大值，與脅迫0 h相比提高了2.88倍，顯著高于其他3份種質(zhì);THA-o6、COM-e8 CAT酶活性呈持續(xù)下降趨勢，脅迫96 h時達(dá)到最小值，分別降低到脅迫0 h的0.27、0.28倍。INA-t5、COM-e8比THA-o6、ECU-ev6 SOD酶活性高，分別呈現(xiàn)波浪變化，INA-t5脅迫48 h時達(dá)到最小值降低到脅迫0 h的0.86倍，脅迫72 h時回升到最大值降低為脅迫0 h的1.06倍;THA-o6 SOD酶活性先降低再回升然后持續(xù)降低，脅迫48 h時回升到脅迫0 h的1.01倍，脅迫96 h時降低到脅迫0 h的0.38倍。以上結(jié)果說明，4 ℃低溫脅迫后THA-o6、ECU-ev6 CAT、SOD、POD酶活性偏向下降趨勢或維持較低水平，而INA-t5、COM-e8 CAT、POD、SOD酶活性偏向上升趨勢或維持較高水平。

3 ?討論

植物體內(nèi)可溶性糖含量、可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛含量與植物低溫等逆境生理密切相關(guān)[9-10]。在逆境脅迫下，植物細(xì)胞通過調(diào)節(jié)可溶性糖和可溶性蛋白的含量，改變細(xì)胞質(zhì)濃度和細(xì)胞保水力能力，緩解細(xì)胞質(zhì)過度脫水，起到保護(hù)細(xì)胞質(zhì)使其不致遇冷結(jié)冰[11]。在許多植物中，可溶性糖與蛋白含量與抗寒性呈現(xiàn)正相關(guān)，可能是由于植物體內(nèi)糖與蛋白質(zhì)合成增加或降解減少[12]。油棕、油橄欖等植物的可溶性糖與蛋白含量隨低溫脅迫程度的增強(qiáng)呈上升趨勢，抗寒性強(qiáng)的品種上升的幅度越大[13-14]。本研究表明，低溫脅迫后可可的可溶性糖和可溶性蛋白都表現(xiàn)含量變化多樣，抗寒鑒定較強(qiáng)的種質(zhì)INA-t5可溶性糖含量呈現(xiàn)上升趨勢，ECU-ev6、THA-o6、COM-e8可溶性糖含量呈現(xiàn)下降趨勢;測試的4份種質(zhì)可溶性蛋白蛋白含量經(jīng)低溫脅迫后，均出現(xiàn)下降隨后表現(xiàn)出少量回升?？赡芤驗榭煽墒菬釒ё魑?，在初次經(jīng)歷極端低溫時體內(nèi)可溶性糖與蛋白質(zhì)進(jìn)行代謝供能導(dǎo)致含量下降，隨著低溫脅迫時間延長植株對外界不良環(huán)境做出應(yīng)激反應(yīng)，可溶性糖和蛋白含量上升，隨著低溫脅迫持續(xù)，細(xì)胞受損結(jié)構(gòu)被破壞，植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量又呈現(xiàn)降低趨勢。

在逆境脅迫下，游離脯氨酸、丙二醛可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑，通過提高細(xì)胞內(nèi)滲透物濃度而降低水勢，使細(xì)胞保持膨壓，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時會使植物體內(nèi)游離脯氨酸和丙二醛的含量迅速積累[15-17]。本研究中，從植株表型判定，INA-t5抗寒性較強(qiáng)，ECU-ev6、THA-o6抗寒性弱;4 ℃低溫脅迫后，ECU-ev6、THA-o6和COM-e8脯氨酸含量先上升后下降，而INA-t5的脯氨酸含量略有上升;ECU-ev6、THA-o6和COM-e8丙二醛含量先下降后上升，INA-t5的丙二醛含量緩步上升。結(jié)果表明可可的脯氨酸和丙二醛含量與其抗寒性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，低溫脅迫后抗寒性強(qiáng)的可可種質(zhì)脯氨酸和丙二醛含量變化不明顯，抗寒性弱的可可種質(zhì)脯氨酸和丙二醛含量波動幅度較為顯著。

在植物體內(nèi)，SOD酶催化底物發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，以清除超氧自由基的解毒作用，POD與SOD功能相似，清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基，防止膜脂質(zhì)過氧化損傷[18-20]; 低溫脅迫下，植物SOD活性一般先升后降[21-23]。4 ℃處理后，INA-t5和COM-e8種質(zhì)中SOD酶活性呈現(xiàn)先升后降趨勢，表明低溫處理條件下，低溫誘使可可SOD酶活性上升，隨低溫脅迫時間持續(xù)，可可植株體內(nèi)積累了大量的活性氧，導(dǎo)致活性氧和防御系統(tǒng)的動態(tài)平衡被打破，進(jìn)而加劇膜脂的過氧化反應(yīng)。4 ℃低溫脅迫下，THA-o6種質(zhì)CAT和POD活性都呈現(xiàn)先升后降的趨勢，INA-t5種質(zhì)CAT活性表現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，說明隨脅迫時間延長，THA-o6種質(zhì)保護(hù)酶系統(tǒng)已經(jīng)被破壞，INA-t5防御系統(tǒng)仍然發(fā)揮作用。

低溫脅迫后，可可的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量和丙二醛，SOD、POD和CAT活性，都會出現(xiàn)顯著性變化?？扇苄蕴呛涂扇苄缘鞍壮尸F(xiàn)波動變化趨勢，丙二醛和脯氨酸含量增幅不明顯，抗寒性強(qiáng)的種質(zhì)抗氧化酶活性能夠持續(xù)活躍。在低溫誘導(dǎo)條件下，抗寒性弱的可可種質(zhì)可溶性蛋白、脯氨酸含量、丙二醛和抗氧化酶活性均出現(xiàn)顯著波動，隨著低溫脅迫持續(xù)進(jìn)行，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，植株的抗氧化酶系統(tǒng)和代謝活動失效，植株抗寒性表現(xiàn)出明顯降低趨勢。本研究得出的滲透物質(zhì)含量和抗氧化酶活性變化應(yīng)答規(guī)律，以及鑒定出的抗寒性差異可可種質(zhì)，為開展可可抗寒分子機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)、可可抗寒品種培育提供材料來源。

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