張燕梅 王瑞芳 楊子平 鹿志偉 李俊峰 趙艷龍 陸軍迎 周文釗

摘 ?要 ?為了篩選劍麻中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，保證基因表達(dá)結(jié)果的可靠性，本研究以熱麻1號為材料，采用實(shí)時熒光定量RT-PCR方法對來自劍麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的8個內(nèi)參基因（EF1α、MADH、ACT2、GAPDH、TUB、ACT54、CYP和EF1β）在煙草疫霉侵染、水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脫落酸（ABA）處理過程中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并結(jié)合GeNorm、BestKeeper和NormFinder軟件綜合評價8個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：8個內(nèi)參基因在不同處理下的表達(dá)穩(wěn)定性存在顯著差異，其中在煙草疫霉侵染和茉莉酸甲酯處理過程中，EF1α表達(dá)最穩(wěn)定，EF1β表達(dá)最不穩(wěn)定。在水楊酸處理過程中，EF1α表達(dá)最穩(wěn)定，ACT2表達(dá)最不穩(wěn)定。在脫落酸處理過程中，GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定，ACT54表達(dá)最不穩(wěn)定。該結(jié)果為劍麻基因的表達(dá)分析提供了可供選擇的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞 ?劍麻;定量RT-PCR;內(nèi)參基因

中圖分類號 ?S563.8 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?In this study， eight reference genes （EF1α， MADH， ACT2， GAPDH， TUB， ACT54， CYP and EF1β） from the transcriptome database， were selected and analyzed in Rema No.1 including Phytophthora nicotianae Breda， MeJA， SA and ABA treatments. Statistical tools， including GeNorm， NormFinder and BestKeeper， were utilized to assess the suitability of reference genes based on the stability rankings for different species. The stability of the eight reference genes was significantly different under different treatments in Rema No.1. For Phytophthora nicotianae Breda and MeJA stresses， EF1α was identified as the most stable gene and EF1β was identified as the least stable gene. For SA stress， EF1α was identified as the most stable gene， and ACT2 was identified as the least stable gene. For ABA stress， GAPDH was identified as the most stable gene， and ACT54 was identified as the least stable gene. The results would provide reliable and optional available reference genes in gene expression analysis of sisal.

Keywords ?sisal; qRT-PCR; reference gene

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.11.010

劍麻是我國熱區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)作物之一，劍麻不僅是主要的熱帶纖維原料[1]，同時劍麻莖心是釀造龍舌蘭酒的主要原料[2]，劍麻麻渣含有較高皂素，可用來制藥[3-4]，劍麻也是一種重要的生物質(zhì)能源[5]，近年來，劍麻作為景天酸代謝的模式植物[6]，有非常重要的理論和經(jīng)濟(jì)價值。

斑馬紋病是劍麻的主要病害之一，主要由煙草疫霉引起。前期利用轉(zhuǎn)錄組測序從熱麻1號中篩選了6849個差異表達(dá)基因[7]，下一步將對部分候選基因進(jìn)行表達(dá)研究，以期了解基因的功能和可能參與的信號途徑。基因表達(dá)研究方法很多，其中qRT-PCR技術(shù)以其簡單、快速、費(fèi)用低且靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)成為目前研究的主要方法之一[8]，由于不同樣本RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄效率以及基因拷貝數(shù)等存在較大差異，在采用該方法時，需要一個表達(dá)相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因來進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[9]。目前，龍舌蘭屬中常采用的內(nèi)參基因有18SrRNA[7， 10]、ACT2[11]、Actin[12]、PU和UBQ11[13]，由于基因表達(dá)受品種、不同器官以及環(huán)境條件影響較大[14-16]，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠，根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件，篩選適宜的內(nèi)參基因十分必要。本研究從劍麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取8個內(nèi)參基因[肌動蛋白（ACT2和ACT54）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、親環(huán)蛋白（CYP）、β微管蛋白（TUB）、蘋果酸酶（MADH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子（EF1α和EF1β）]，利用GeNorm[17]、BestKeeper[18]和NormFinder[19]統(tǒng)計(jì)軟件，篩選熱麻1號在煙草疫霉侵染、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）和脫落酸（ABA）處理過程中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究不僅改善了劍麻內(nèi)參基因少的現(xiàn)狀，還為劍麻基因表達(dá)研究提供了可選擇的內(nèi)參基因，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

用于煙草疫霉接種的為兩年生熱麻1號盆栽苗，用于MeJA、SA和ABA處理的為8～10 cm的熱麻1號組培苗。菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存的煙草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda de Haan）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?病原接種 ?將保存于PDA斜面的煙草疫霉轉(zhuǎn)接到V8培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1周后接種。接種前先用酒精棉反復(fù)擦拭葉片，然后用滅菌大頭針刺傷葉片表面，取直徑0.5 cm大小的菌餅將帶菌絲面貼于傷口處，用棉花保濕，每隔2 h加1次水，每個生物學(xué)重復(fù)當(dāng)作1個處理，每個處理重復(fù)3次。分別在接種0、24、36、48、72 h取熱麻1號葉片，經(jīng)液氮速凍后?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?激素處理 ?取8～10 cm的劍麻組培苗，分別在培養(yǎng)基中加入1 mL SA（10 mmol/L）、MeJA（1 mmol/L）和ABA（0.1 mmol/L）溶液，蓋上蓋子，靜置放于桌面上;每瓶苗當(dāng)做1個處理，每個處理重復(fù)3次;分別在處理前（0 h）、處理3、6、12、24 h取組培苗葉片，液氮速凍后?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ?RNA提取和cDNA合成 ?用植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）提取總RNA，取0.5 ?g總RNA用于cDNA第1鏈的合成。cDNA第1鏈的合成采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，合成的cDNA按1∶5比例稀釋后?20 ℃保存?zhèn)溆?。所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 ?引物合成 ? 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的核酸序列，采用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier3.0[20]設(shè)計(jì)內(nèi)參基因引物，引物長度為18～23 bp，Tm值在57～62 ℃之間，產(chǎn)物大小在100～200 bp之間，并在NCBI上對引物的特異性進(jìn)行檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.5 ?內(nèi)參基因目的片段的PCR擴(kuò)增 ? PCR反應(yīng)體系：2×NOVA Taq-Plus PCR Forest Mix（江蘇愚公生命科技有限公司），10 ?L;引物（10 ?mol/L）F 0.2 ?L，R 0.2 ?L;cDNA 2 ?L;滅菌ddH2O 7.6 ?L。PCR擴(kuò)增程序：先預(yù)變性95 ℃，5 min;然后進(jìn)入35個循環(huán)（95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s）;最后72 ℃，10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測為單一條帶的引物，將進(jìn)行下一步的熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.2.6 ?內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增 ? 熒光定量PCR擴(kuò)增采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒，具體操作按說明書進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×TransStart? Top Green qPCR SuperMix 10 ?L;cDNA 2 ?L;引物（10 ?mol/L）F 0.4 ?L，R 0.4 ?L;滅菌ddH2O 7.2 ?L。擴(kuò)增程序：先預(yù)變性95 ℃，1 min，然后進(jìn)入45個循環(huán)（95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）;每個樣品設(shè)置3次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，根據(jù)熔解曲線確定產(chǎn)物的特異性。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

實(shí)時熒光定量RT-PCR后，儀器會自動得出Ct值，首先利用GeNorm[17]、NormFinder[19]和BestKeeper[18]軟件分別計(jì)算出不同處理下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性（M值）、穩(wěn)定值（SV值）和變異系數(shù)（CV）/標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）值，并根據(jù)M值、SV值和CV/SD值按從小到大對內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，值越小對應(yīng)的內(nèi)參基因越穩(wěn)定。最后根據(jù)geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件的排序結(jié)果，計(jì)算出每個內(nèi)參基因穩(wěn)定性綜合排序。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?內(nèi)參基因的選擇

在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，基因表達(dá)量的計(jì)算常用的是FPKM（fragments per kb per million reads）算法[21]，其中FPKM值的高低代表基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)的高低。由于劍麻已知的內(nèi)參基因較少，因此在選擇基因時，根據(jù)劍麻轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)，選擇轉(zhuǎn)錄本數(shù)較高的，且在煙草疫霉接種過程中表達(dá)穩(wěn)定的基因作為候選內(nèi)參基因（表1）。包括肌動蛋白2（ACT2）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子1-（EF1）、親環(huán)蛋白（CYP）、β微管蛋白（TUB）、蘋果酸酶（MADH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子1-β（EF1β）、肌動蛋白54（ACT54）。

2.2 ?引物特異性分析

電泳檢測結(jié)果顯示8個候選內(nèi)參基因均擴(kuò)增出單一條帶，且條帶大小與預(yù)期產(chǎn)物相符（圖1），表明引物特異性較好，可用于實(shí)時熒光定量RT-PCR分析。而實(shí)時熒光定量RT-PCR熔解曲線分析則表明，8個基因的溶解曲線均呈現(xiàn)顯著的單一峰（圖2），可用于內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析。

2.3 ?內(nèi)參基因表達(dá)分析

內(nèi)參基因的Ct值反映基因的表達(dá)水平，Ct值越低表示基因的表達(dá)豐度越高。并且同一基因在不同條件下的Ct值變化反應(yīng)基因表達(dá)水平的變化，Ct變化越小則該基因穩(wěn)定性越好。8個候選內(nèi)參基因Ct平均值在21.70～29.47之間，其中EF1β的平均Ct值最大，為29.47，即該基因的表達(dá)豐度最低，EF1α的Ct平均值最小，為21.70，即該基因的表達(dá)豐度最高。從Ct值的分布圖可以看出，8個內(nèi)參基因的表達(dá)豐度從高到低依次為EF1α>ACT2> GAPDH>ACT54>TUB>MADH>CYP>EF1β（圖3）。

2.4 ?內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1 ?GeNorm分析 ?GeNorm內(nèi)參分析軟件根據(jù)計(jì)算出的候選內(nèi)參基因在不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性來確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，M值越大，則基因的穩(wěn)定性越低，M值越小，基因的穩(wěn)定性越高。一般地，M≤1.5才視為穩(wěn)定表達(dá)[17]。GeNorm分析結(jié)果表明，在煙草疫霉侵染過程中，EF1α和MADH的穩(wěn)定值最低，為0.65，TUB的穩(wěn)定值最高，為1.14，即在煙草疫霉侵染過程中，EF1α和MADH表達(dá)最穩(wěn)定，TUB表達(dá)最不穩(wěn)定。SA處理過程中，EF1α和GAPDH的M值最小，為0.29，ACT2的M值最大，為1.28，即在SA處理過程中，EF1α和GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定，ACT2表達(dá)最不穩(wěn)定。MeJA處理過程中，EF1α和ACT2的M值最小，為0.16，MADH的M值最大，為1.96，即在MeJA處理過程中EF1α和ACT2表達(dá)最穩(wěn)定，MADH表達(dá)最不穩(wěn)定。ABA處理過程中，GAPDH和ACT2的M值最低，為0.82，EF1β的M值最高，為3.28，即在ABA處理過程中，GAPDH和ACT2表達(dá)最穩(wěn)定，EF1β表達(dá)最不穩(wěn)定（圖4）。

2.4.2 ?NormFinder分析 ?NormFinder是結(jié)合組內(nèi)方差與組間方差計(jì)算候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值進(jìn)行評價，SV值越小，內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定[19]。NormFinder分析顯示，在煙草疫霉侵染過程中，EF1α表達(dá)最穩(wěn)定（SV=0.30），TUB表達(dá)最不穩(wěn)定（SV=0.78），在SA處理過程中，GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定（SV=0.08），ACT2表達(dá)最不穩(wěn)定（SV= 1.79）。在MeJA處理過程中，ACT2表達(dá)最穩(wěn)定（SV=0.06），MADH表達(dá)最不穩(wěn)定（SV=1.86）。在ABA處理過程中，GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定（SV= 0.28），ACT2表達(dá)最不穩(wěn)定（SV=3.78）（圖5）。

2.4.3 ?Bestkeeper分析 ?Bestkeeper是通過計(jì)算變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差來反映內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，其中變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之穩(wěn)定性越差[18]。BestKeeper分析表明，在煙草疫霉侵染過程中，EF1α的CV和SD最?。–V=0.95;SD=0.19），表達(dá)最穩(wěn)定，EF1β表達(dá)最不穩(wěn)定（CV=3.56;SD=0.9）。在SA處理過程中，EF1α表達(dá)最穩(wěn)定（CV=1.3;SD=0.3），ACT2表達(dá)最不穩(wěn)定（CV=5.56;SD=1.34）。在MeJA處理過程中，EF1α表達(dá)最穩(wěn)定（CV=2.39;SD=0.56），MADH表達(dá)最不穩(wěn)定（CV=8.54;SD=2.51）。在ABA處理過程中，EF1α（SD最小，為1.35）和CYP表達(dá)最穩(wěn)定（CV最小，為6.04），ACT54最不穩(wěn)定（CV=3.46;SD=14.74）（圖6）。

2.4.4 ?綜合性分析 ?對GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析得到的穩(wěn)定性排名求幾何平均值，得到綜合指數(shù)排名，指數(shù)越小，說明內(nèi)參基因表達(dá)越穩(wěn)定。由圖7可見，8個候選內(nèi)參基因在煙草疫霉侵染過程中基因表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為EF1α、MADH、ACT2、GAPDH、TUB、ACT54、CYP、EF1β;MeJA處理過程中基因表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為EF1α、ACT2、GAPDH、ACT54、CYP、TUB、EF1β、MADH;SA處理過程中基因表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為EF1α、GAPDH、ACT54、MADH、EF1β、TUB、CYP、ACT2;ABA處理過程中基因表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為GAPDH、CYP、ACT2、EF1α、TUB、MADH、EF1β、ACT54（圖7）。

3 ?討論

一般認(rèn)為，理想的內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段、不同組織以及不同逆境條件下表達(dá)穩(wěn)定且表達(dá)水平與目標(biāo)基因相近，并且常常選擇管家基因如ACTIN、TUB、GAPDH、EF1α等作為內(nèi)參基因[9， 16， 22-23]。但越來越多的研究表明，管家基因的表達(dá)水平會受不同實(shí)驗(yàn)條件影響而發(fā)生變化[24-25]，因此，根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)虮磉_(dá)分析尤為重要，并且在多種植物中均有報(bào)道[25-27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，同一基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性存在較大差異，如ACT2在MeJA處理過程中表達(dá)最穩(wěn)定，在SA處理過程中表達(dá)最不穩(wěn)定。研究還發(fā)現(xiàn)同一基因家族中的不同成員，表達(dá)穩(wěn)定性也存在較大差異。如EF1α和EF1β在煙草疫霉侵染過程中表達(dá)最穩(wěn)定，EF1β最不穩(wěn)定。Rudu?等[27]也發(fā)現(xiàn)野生燕麥中的GAPDH1和GAPDH2的穩(wěn)定性也存在很大差異。由此可見，內(nèi)參基因并不是通用的，其選擇要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件而定，同時也說明篩選和開發(fā)新的內(nèi)參基因的重要性。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)劍麻新的內(nèi)參基因，通過表達(dá)分析證實(shí)了新開發(fā)的基因EF1α在MeJA、SA和ABA處理過程中表達(dá)較常用的Actin[11-12]更穩(wěn)定。隨著組學(xué)時代的發(fā)展，利用RNA-Seq挖掘新的內(nèi)參基因顯得尤為突出也十分重要[28-30]。如Gao等[29]利用轉(zhuǎn)錄組序列篩選出條斑紫菜適應(yīng)于失水和低溫等非生物脅迫的內(nèi)參基因MAP、UBC和FHP，在脫水脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因CGS1和UBC，低溫脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因MAP、UBC和CGS1。Xu等[30]發(fā)現(xiàn)Fb15和eIF-4a在水稻胚乳發(fā)育過程中的表達(dá)比ACT、GAPDH等11個常用的管家基因更穩(wěn)定。鑒于此，本研究對劍麻煙草疫霉、SA、MeJA和ABA處理后的內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)分析，篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，為劍麻下一步的基因功能研究提供可供選擇的內(nèi)參基因，具有十分重要的意義。

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