劉金雷　劉天佳　于瑩等

摘要：自然界中的木質(zhì)素是潛在的豐富的可再生資源，近年來(lái)利用生物法降解木質(zhì)素成為研究的熱點(diǎn)。利用RT-PCR克隆了黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因（LiP）、錳過(guò)氧化物酶基因（MnP）、黑曲霉（Asperillus niger）葡萄糖氧化酶基因（gox）及白腐真菌（White Rot Fungi）漆酶基因（Lac），并構(gòu)建了畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化入Pichia pastoris X-33宿主菌中，獲得轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行微培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的酶活，篩選出高酶活菌株。對(duì)4種重組菌株進(jìn)行發(fā)酵，以經(jīng)過(guò)處理的玉米皮作為底物，分別加入4種酶的發(fā)酵液及4種酶的混合液，于30 ℃反應(yīng)后測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間木質(zhì)素的降解量，反應(yīng)24h，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、漆酶吸光度D280nm的降低幅度分別為45%、39%、9%、57%；復(fù)合酶降解木質(zhì)素的活性明顯高于單一酶，吸光度的降低幅度為78%，說(shuō)明木質(zhì)素降解酶系的相互協(xié)同作用，提高了木質(zhì)素的降解效率，為木質(zhì)素酶解提供了新方法。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)素；降解酶系；新方法；異源表達(dá)；畢赤酵母；酶活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S188+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0058-05

收稿日期：2014-11-16

作者簡(jiǎn)介：劉金雷（1988—），男，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿佣ㄏ蜻M(jìn)化與生物催化。E-mail：1060083086@qq.com。

通信作者：李天明，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)榉肿佣ㄏ蜻M(jìn)化與生物催化。E-mail：iamltm2000@hotmail.com。木質(zhì)素是一種豐富的天然可再生的有機(jī)高分子化合物，廣泛存在于植物體中，它包圍著纖維素，和半纖維素一起填充于微原纖維之間，與纖維素、半纖維素一起構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分，是自然界中植物光合作用制造的總量?jī)H次于纖維素的碳素資源[1]。據(jù)估計(jì)，全世界每年由植物生長(zhǎng)產(chǎn)生的木質(zhì)素達(dá)1 500億t，其中造紙工業(yè)廢液中產(chǎn)生的工業(yè)木質(zhì)素有3 000萬(wàn)t[2]，因此對(duì)大自然給予人類(lèi)的木質(zhì)素等豐富的可再生天然資源予以充分重視并加以研究和利用，對(duì)于可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易分解[3-4]，從20世紀(jì)開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者一直尋找木質(zhì)素降解的最佳途徑，研究?jī)?nèi)容主要包括物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法、生物降解法[5]。木質(zhì)素的微生物降解不僅可以緩解環(huán)境污染、變廢為寶，而且對(duì)生物質(zhì)資源的充分利用有重大的現(xiàn)實(shí)意義，因此對(duì)木質(zhì)素的生物降解已經(jīng)成為當(dāng)今世界國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[6-9]。木質(zhì)素的降解是由一系列酶協(xié)同完成的，目前已知，在降解木質(zhì)素過(guò)程中起主導(dǎo)作用的主要是漆酶（laccase，LAC）、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（lignin peroxidase，LIP）、錳過(guò)氧化物酶（manganese peroxidase，MNP）這3種酶[10]。此外，葡萄糖氧化酶（glucose 1-oxidase，GO）、芳醇氧化酶（aryl-alcohol oxidase，AAO）、乙二醛氧化酶（gyoxaloxidase，GLOX）等也對(duì)木質(zhì)素的降解產(chǎn)生一定的影響或者直接參與其降解[11]。

木質(zhì)素降解的相關(guān)酶最早是在白腐真菌的胞外培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的，近年來(lái)隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)木質(zhì)素降解酶系的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)在自然界中木質(zhì)素的降解是由真菌、細(xì)菌、放線菌三者共同作用的結(jié)果，其中真菌起主要作用[12]。自然界中降解木質(zhì)素能力最強(qiáng)的一類(lèi)真菌是白腐菌[13-16]，白腐菌雖然有廣譜的酶系統(tǒng)，但是由于其生理代謝的特殊性以及近乎苛刻的對(duì)環(huán)境因子的要求，對(duì)于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化產(chǎn)酶產(chǎn)生了嚴(yán)重阻礙。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程菌的構(gòu)建和木質(zhì)素酶系的異源表達(dá)成為從根本上解決這一問(wèn)題的一種可能的途徑。本研究主要利用基因重組技術(shù)，利用畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌表達(dá)了不同來(lái)源的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶基因，利用工程菌的發(fā)酵液降解天然木質(zhì)素，并通過(guò)木質(zhì)素降解酶系的協(xié)同作用，增強(qiáng)了木質(zhì)素的降解效率，為木質(zhì)素酶解提供了新方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種和質(zhì)粒大腸桿菌Trans 5α菌株購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，P. pastoris X-33菌株和表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA由河北科技大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、黑曲霉（Asperillus niger）、白腐真菌（White Rot Fungi）為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏的野生型菌株。

1.1.2培養(yǎng)基LB、YPDS、YPD培養(yǎng)基均按照《Invitrogen公司操作手冊(cè)》推薦的方法配制。

1.1.3試劑限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、BcabestTM RNA PCR試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaRaKa）；Trizol Reagent，購(gòu)自Gibco公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PMD-18克隆載體，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；DNA測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司完成。如無(wú)特別說(shuō)明，所有的化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1基因的操作質(zhì)粒提取、酶切反應(yīng)、DNA片段回收、連接以及大腸桿菌轉(zhuǎn)化等均參照試劑盒提供的方法進(jìn)行操作。

1.2.2基因的克隆采用液氮研磨-SDS法提取黃孢原毛平革菌、黑曲霉和白腐真菌總RNA，以合成的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，純化PCR產(chǎn)物，與PMD-18連接，構(gòu)建PMD-18-LiP、PMD-18-MnP、PMD-18-gox、PMD-18-Lac質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含150 μg/L 氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，提質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.2.3重組表達(dá)載體的構(gòu)建載體pGAPZαA用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，產(chǎn)生的3.1 kbDNA片段用DNA回收試劑盒回收純化。以測(cè)序驗(yàn)證正確的含有Lac基因的PMD-18-Lac質(zhì)粒作模板PCR，PCR片段用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，1.5 kb片段用上述方法純化，將片段與用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切后的pGAPZαA片段用T4連接酶于16 ℃過(guò)夜連接；連接液轉(zhuǎn)化E.coli Trans5α，涂布于含有博萊霉素（Zeocin）（100 mg/L）的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)選取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，PCR分子驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子用EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切再次驗(yàn)證，將重組質(zhì)粒送相應(yīng)公司測(cè)序。LiP、MnP、gox、Lac基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法一樣，只是酶切位點(diǎn)不同，LiP基因的酶切用EcoRⅠ/NotⅠ，MnP基因的酶切用EcoRⅠ/NotⅠ，gox基因的酶切用KpnⅠ/NotⅠ，Lac基因的酶切用EcoRⅠ/KpnⅠ，從而得到表達(dá)載體GAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac。

1.2.4酶活測(cè)定

1.2.4.1木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LIP）酶活的測(cè)定[17]2 mL反應(yīng)體系中含0.4 mL發(fā)酵液（或稀釋酶液）、10 mmol/L藜蘆醇、50 mmol/L酒石酸緩沖液（pH值2.5），加入0.4 mmol/L H2O2 啟動(dòng)反應(yīng)，30 ℃反應(yīng)2 min后，以不加發(fā)酵液、用蒸餾水補(bǔ)齊的2 mL反應(yīng)液作對(duì)照，用酶標(biāo)儀在310 nm處測(cè)定吸光度D310 nm。

1.2.4.2錳過(guò)氧化物酶（MNP）酶活的測(cè)定[18]2 mL反應(yīng)體系中含0.4 mL 發(fā)酵液（或稀釋酶液）、100 μmol/L MnSO4、0.01%苯酚紅、0.1%牛血清蛋白、25 mmol/L乳酸鋰、50 mmol/L 酒石酸緩沖液（pH值4.5），加入0.1 mmol/LH2O2 啟動(dòng)反應(yīng)，于30 ℃反應(yīng)5 min后，加入100 μL 2mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，以先加終止劑的作對(duì)照，測(cè)610 nm處的吸光度D610 nm。

1.2.4.3葡萄糖氧化酶（GO）酶活的測(cè)定[19]5 mL反應(yīng)體系含0.7 mL發(fā)酵液（或稀釋酶液）、0.04 mol/L葡萄糖、3 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH值 4）、1.3 mL靛藍(lán)胭脂紅溶液（1.0×10-3 mol/L），于37 ℃條件下反應(yīng)10 min，再于100 ℃水浴13 min，用流水冷卻5 min以終止反應(yīng)，以不加發(fā)酵液用蒸餾水補(bǔ)齊的等量體系作對(duì)照，測(cè)615 nm處的吸光度D615 nm。

1.2.4.4漆酶（LAC）酶活的測(cè)定[20-21]3 mL反應(yīng)體系中含有2.95 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH值3.4）、1 mL 1 mol/L ABTS、0.05 mL稀釋后的酶液，于25 ℃反應(yīng)3 min后，對(duì)照為未加ABTS同體積的反應(yīng)混合液，用酶標(biāo)儀在420 nm下測(cè)定吸光度D420 nm。

1.3畢赤酵母重組菌株的獲得及鑒定

將重組質(zhì)粒用BspH I酶切，使其完全線性化，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞中，感受態(tài)細(xì)胞及電轉(zhuǎn)化過(guò)程參照《Invitrogen公司操作手冊(cè)》[22]。電轉(zhuǎn)化液均勻涂布到含100 mg/L Zeocin的YPDS培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)2～3 d至長(zhǎng)出重組子。將平板上生長(zhǎng)的重組子分別挑取到含有3 mL YPD培養(yǎng)基的24孔板中，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，漆酶重組菌株培養(yǎng)5 d，木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶重組菌株培養(yǎng)3 d，根據(jù)上述方法測(cè)定酶活。高溫裂解高酶活酵母轉(zhuǎn)化子，獲得其DNA，以此為模板，用目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定。

1.4重組菌株對(duì)天然木質(zhì)素玉米皮的酶解

將木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶的重組酵母工程菌株和轉(zhuǎn)有空質(zhì)粒的對(duì)照酵母菌株于25 mL YPD培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)（200 r/min），木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶及葡萄糖氧化酶工程菌株培養(yǎng)3 d，漆酶工程菌株及轉(zhuǎn)有空質(zhì)粒的對(duì)照酵母菌株培養(yǎng)5 d，4 000 r/min離心 5 min，得到上清液。取1 mL 5株菌的上清液加入到4mL經(jīng)0.1 mol/L氫氧化鈉溶液預(yù)處理的玉米皮上清液中，另各取250 μL木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶的工程菌株發(fā)酵上清液混合，加入到4 mL用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液浸泡24 h的玉米皮上清液中，置于 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中降解木質(zhì)素。用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)零，于280 nm處測(cè)吸光度D280nm，吸光度的降低值表征木質(zhì)素的降解量。為了降低誤差，平行做3組玉米皮的酶解試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1LiP、MnP、gox、Lac基因表達(dá)載體的構(gòu)建及序列測(cè)定和分析

LiP基因的純化回收片段與載體pGAPZαA用EcoRⅠ/NotⅠ酶切，MnP基因的純化回收片段用EcoRⅠ/NotⅠ酶切，gox基因的純化回收片段用KpnⅠ/NotⅠ酶切，Lac基因的純化回收片段用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切。T4連接酶于16 ℃過(guò)夜連接，連接液轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli Trans5α，構(gòu)建pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac質(zhì)粒。挑選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，分別用4種基因的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，從圖1可以看出，LiP、MnP、gox、Lac基因與載體連接成功；重組陽(yáng)性質(zhì)粒pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac經(jīng)測(cè)序結(jié)果表明，LiP基因長(zhǎng)1 003 bp，MnP基因長(zhǎng)1 100 bp，gox基因長(zhǎng)1 963 bp，Lac基因長(zhǎng)1 563 bp。將基因序列用DNAclub翻譯為氨基酸序列后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，LiP、MnP基因與黃孢原毛平革菌的同源性達(dá)100%，gox基因與黑曲霉的同源性達(dá)100%，Lac基因與白腐真菌的同源性達(dá)100%，說(shuō)明構(gòu)建pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac成功。

2.2轉(zhuǎn)化與高表達(dá)工程菌株的篩選

用電轉(zhuǎn)化方法分別將重組表達(dá)載體pGAPZαA-LiP、pGAPZαA-MnP、pGAPZαA-gox、pGAPZαA-Lac和空載體pGAPZαA轉(zhuǎn)化到畢赤氏酵母中，電轉(zhuǎn)化液均勻涂布到Y(jié)PDS培養(yǎng)基上，Zeocin濃度為100 mg/L，在平板上分別獲得轉(zhuǎn)化子。采用24孔板微培養(yǎng)抗性轉(zhuǎn)化子，以酶活性為篩選指標(biāo)，依據(jù)上述測(cè)定酶活方法等比例縮小反應(yīng)體系為200 μL，采用96孔板測(cè)定吸光度，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。木質(zhì)素過(guò)氧化物酶工程菌株發(fā)酵3 d，共篩選了561個(gè)轉(zhuǎn)化子，篩選出酶活力較大且酶活穩(wěn)定的2株工程菌株（表1）；錳過(guò)氧化物酶工程菌株發(fā)酵3 d，共篩選了632個(gè)轉(zhuǎn)化子，篩選出酶活力較大且酶活穩(wěn)定的5株工程菌株（表2）；葡萄糖氧化酶發(fā)酵3 d，共篩選了731個(gè)轉(zhuǎn)化子，篩選出酶活力較大且酶活穩(wěn)定的2株工程菌株（表3）；漆酶發(fā)酵5 d，測(cè)定酶活，共篩選了863個(gè)轉(zhuǎn)化子，篩選出酶活力較大且酶活穩(wěn)定的3株工程菌株（表4）。

2.3工程菌株的鑒定

篩選出的酶活較高的工程菌株經(jīng)分離純化后，用PCR方法對(duì)篩選得到的工程菌株進(jìn)行鑒定，pGAPZαA-LiP轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33所得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2；pGAPZαA-MnP轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33所得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3；pGAPZαA-gox轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33所得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4；pGAPZαA-Lac轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33所得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.4單一酶和復(fù)合酶對(duì)天然木質(zhì)素的降解效果

玉米皮水溶性差，直接加入降解酶會(huì)影響酶的降解效果，OH-能夠減弱纖維素與半纖維素之間的氫鍵，并且皂化半纖維素與木質(zhì)素分子之間的酯鍵，使木質(zhì)素釋放出玉米皮結(jié)構(gòu)組織，因此應(yīng)先將玉米皮用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡24 h。將高酶活表達(dá)的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶基因的工程菌株發(fā)酵液于4 000 r/min離心，取上清液。將4種酶及轉(zhuǎn)有空質(zhì)粒的對(duì)照酵母菌株的上清液分別加入玉米皮上清液中，將4種酶的上清液等比例配

合后也加入到玉米皮的上清液中，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中降解木質(zhì)素，用酶標(biāo)儀在280 nm處測(cè)0、6、12、18、24 h的吸光度，吸光度的下降幅度表征木質(zhì)素的降解量，詳見(jiàn)圖6。根據(jù)木質(zhì)素降解造成的吸光度遞減數(shù)據(jù)可知，4種酶均對(duì)木質(zhì)素有一定的降解作用，其中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、漆酶的降解活性高于錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶；木質(zhì)素與過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶反應(yīng)24 h，D280nm的降低幅度分別為45%、39%、9%、57%，復(fù)合酶降解木質(zhì)素的活性明顯高于單一酶，D280nm的降低幅度為78%，說(shuō)明復(fù)合酶增強(qiáng)了木質(zhì)素的降解效率。

3討論

Raymond報(bào)道用Pichia methanolica表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶，產(chǎn)生的蛋白量達(dá)到500 mg/L[23]；國(guó)際上亦曾報(bào)道畢赤酵母中漆酶基因的最高酶活達(dá)到11.5 U/mL[24]；關(guān)于錳過(guò)氧化物酶基因在Pichia pastoris中異源表達(dá)的報(bào)道較少，Gu等在2000年發(fā)表的會(huì)議論文中報(bào)道，重組錳過(guò)氧化物酶的酶活力為7 U/L[25]。目前，葡萄糖氧化酶的研究主要集中在來(lái)源于青霉和黑曲霉的基因，Whittington等在釀酒酵母中成功表達(dá)了來(lái)源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因[26-27]；母敬郁等采用瑞式木霉表達(dá)了黑曲霉來(lái)源的葡萄糖氧化酶基因[28]；國(guó)內(nèi)外的研究人員也在畢赤酵母中成功表達(dá)了來(lái)源于青霉和黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因[29-30]。本研究采用RT-PCR方法克隆了黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）來(lái)源的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶基因（LiP）、錳過(guò)氧化物酶基因（MnP），黑曲霉（Asperillus niger）來(lái)源的葡萄糖氧化酶基因（gox）及白腐真菌（White Rot Fungi）來(lái)源的漆酶基因（Lac），氨基酸序列與NCBI報(bào)道的同源性達(dá)到100%。

對(duì)于木質(zhì)素降解酶系的異源表達(dá)，研究人員嘗試了不同的表達(dá)系統(tǒng)，包括昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)以及酵母表達(dá)系統(tǒng)[31]。結(jié)果表明，相比較而言木質(zhì)素降解酶系在酵母中的表達(dá)比較成功。釀酒酵母是最早用于表達(dá)的酵母菌，但它有一定的局限性，因此科研工作者將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到畢赤酵母上，畢赤酵母有其他表達(dá)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，它既有原核生物易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)基廉價(jià)和試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，而且有強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，可對(duì)異源蛋白進(jìn)行加工折疊和翻譯后修飾，然后分泌到胞外，具有典型的真核生物表達(dá)體系的特點(diǎn)[32]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量高，易于大規(guī)模培養(yǎng)，同時(shí)生產(chǎn)成本低，能進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾，且生物安全性高，到目前為止已經(jīng)有超過(guò)500種蛋白在畢赤酵母中得到了高效表達(dá)[33]。隨著畢赤酵母基因測(cè)序工作的完成[34]，畢赤酵母的代謝調(diào)控信息會(huì)更加明晰，所以重組蛋白的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)會(huì)得到進(jìn)一步的發(fā)展。本研究分別構(gòu)建了4種酶的畢赤酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主X33，采用24孔板微培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，再利用酶標(biāo)儀測(cè)定酶活力，高酶活菌株再做PCR進(jìn)一步確認(rèn)，提高了篩選效率，建立了1種簡(jiǎn)單快速、高通量篩選方法，提高了異源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的效率。

本研究利用畢赤酵母成功分泌表達(dá)了漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和葡萄糖氧化酶，借鑒其他研究者酶活的測(cè)定方法，采用特定底物，都分別表現(xiàn)了各自的酶活性。與其他研究者不同的是，本研究采用了玉米皮作為底物，與4種酶的發(fā)酵液及其混合液反應(yīng)，研究其發(fā)酵液對(duì)天然木質(zhì)素的降解效果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種酶對(duì)玉米皮中的木質(zhì)素成分均有降解作用，而且復(fù)合酶的酶活水平比單一酶的酶活明顯提高，降解效率提高了2倍左右。木質(zhì)素降解酶系的協(xié)同作用，提高了木質(zhì)素的降解效率，這在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中未見(jiàn)報(bào)道，為探索木質(zhì)素酶解的新方法、新途徑提供了一個(gè)全新思路。

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