龔美玲，張琳琳，鄭翠俠

同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海200090

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2［nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2，NRF2］是一個(gè)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，與核轉(zhuǎn)錄因子E2（nuclear factor-erythroid derived 2，NF-E2）、核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子1（nuclear factor erythroid 2-related factor 1，NRF1）及核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子3（nuclear factor erythroid 2-related factor 3，NRF3）等同屬Cap“n”Collar（CNC）家族［1-2］。NRF2是一個(gè)抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子［3］。在正常穩(wěn)態(tài)環(huán)境下，NRF2與細(xì)胞質(zhì)中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合，導(dǎo)致NRF2被降解。而在氧化應(yīng)激環(huán)境中，KEAP1與NRF2解離，NRF2進(jìn)入細(xì)胞核中與小Maf蛋白形成二聚體結(jié)構(gòu)與抗氧化元件ARE結(jié)合，激活下游抗氧化基因、解毒基因及細(xì)胞代謝相關(guān)基因的表達(dá)［4］。NRF2已被證明與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥相關(guān)，如乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚腫瘤、膀胱癌及肺癌等［5-10］。

NRF2擁有7個(gè)高度保守的Neh（Nrf2-ECH homology）同源結(jié)構(gòu)域，即Neh1～Neh7。其中Neh1位于近羧基端，主要包含一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈bzip（basic leucine zipper）區(qū)，是一個(gè)DNA結(jié)合域，而且可以與小Maf蛋白形成二聚體促進(jìn)與抗氧化元件ARE結(jié)合［11-13］；Neh2包含7個(gè)可受泛素化修飾的賴氨酸殘基以及2個(gè)Keap1結(jié)合位點(diǎn)（ETGE和DLG），對(duì)NRF2的活性和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)極為重要［14-15］；Neh3區(qū)域通過招募共激動(dòng)劑染色質(zhì)解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白6（chromodomain helicase DNA binding protein 6，CHD6)，上調(diào)NRF2目標(biāo)基因表達(dá)水平［16］；Neh4和Neh5區(qū)域協(xié)同招募CBP參與ARE調(diào)控下游靶基因［17］；Neh6結(jié)構(gòu)域是富含絲氨酸的區(qū)域，其參與NRF2穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)節(jié)，而且與Keap1無(wú)關(guān)［18］；Neh7結(jié)構(gòu)域研究較少，與視黃酸X受體α結(jié)合可抑制NRF2基因轉(zhuǎn)錄［19］。

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)NRF2基因進(jìn)行敲除，敲除序列選擇在CNCbzip區(qū)，bzip區(qū)主要通過與小分子肌腱纖維肉瘤（small masculoaponeurotic fibrosarcoma，sMaf）蛋白形成二聚體從而與下游抗氧化元件ARE結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。該結(jié)構(gòu)域一旦被敲除，NRF2主要功能喪失，下游相關(guān)抗氧化基因、解毒酶基因等表達(dá)下降，從而使肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力下降。

1 材料和方法

1.1 材料

肺腺癌細(xì)胞株（A549）、人胚腎細(xì)胞株（HEK-293T）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，pLenti CRISPR v2載體購(gòu)自領(lǐng)?。ㄉ虾＃┥锟萍加邢薰?，BbsI酶、BsmBI酶、T4DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，Blasticidins購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，LipofectamineTM2000試劑、Ham's F-12K（Kaighm's）培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）檢測(cè)試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，結(jié)晶紫購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell板（24孔、孔徑8.0 μm）購(gòu)自美國(guó)Corning公司，寡核苷酸序列由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸序列合成

采用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/）根據(jù)評(píng)分系統(tǒng)，在NRF2基因的第5外顯子設(shè)計(jì)2個(gè)sgRNA（sgRNA-F，sgRNA-R）。寡核苷酸序列見表1。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Table 1 sgRNA oligonucleotide sequences

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建［20］

把2條sgRNA寡核苷酸單鏈退火連接，用BsmBI酶將pLenti CRISPR v2載體線性化，然后利用T4連接酶過夜將退火后的產(chǎn)物連接到線性化的載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑單克隆菌落并抽取質(zhì)粒送至公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 慢病毒質(zhì)粒包裝［21］

病毒包裝是我們實(shí)驗(yàn)室比較成熟的一項(xiàng)技術(shù)。根據(jù)pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R質(zhì)粒與慢病毒包裝載體PSPAX2，PMD2.G之間的摩爾質(zhì)量比，計(jì)算出各自需要的量，實(shí)現(xiàn)pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R質(zhì)粒的共同轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，6 h后換成含血清的高糖DMEM培液，48 h后收集病毒上清液，與polybreen（聚凝胺，轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑）（8 μg/mL）比例充分混合后加入A549細(xì)胞培養(yǎng)板中，72 h后棄去培液，加入含Blasticidins（20 μg/mL）的F-12K培養(yǎng)基，篩選7 d后，將剩余存活細(xì)胞鋪至96孔板，保證每孔1個(gè)細(xì)胞，數(shù)天后開始挑取單克隆細(xì)胞，提取細(xì)胞DNA。然后在靶序列兩端設(shè)計(jì)引物（表2），RTFQ-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序。

表2 靶序列擴(kuò)增引物Tab.2 Target sequence amplification primers

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的細(xì)胞裂解液提取3株純合敲除細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按每組20 μg等量上樣，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，2 h。剪膜。采用5%BSA封閉2 h后按1∶2 000溫育NRF2一抗抗體（美國(guó)Abcam公司），HO-1一抗抗體（CST）。β-actin（CST）。4 ℃慢搖過夜，12～18 h后回收一抗，1×TBST洗3次，每次10 min，室溫按1∶5 000溫育二抗抗體2 h，回收二抗，1×TBST洗3次，每次10 min，最后顯影。

1.2.5 RTFQ-PCR檢測(cè)

TRIzol法提取3株純合敲除細(xì)胞RNA，采用寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄及RTFQ-PCR試劑盒，比較未敲除組與敲除組NRF2基因及下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，分別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)［21］

胰酶將細(xì)胞消化下來后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)3次，每孔按1 000個(gè)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行鋪板，挑選一株敲除細(xì)胞（NRF2 sgRNA-2）與未敲除細(xì)胞（A549）進(jìn)行對(duì)比，10%FBS的完全培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d。鏡下觀察到大于50個(gè)細(xì)胞的克隆出現(xiàn)時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，加入甲醇固定15 min，PBS洗3遍。每孔加入1 mL結(jié)晶紫10 min，吸出后緩慢沖洗干凈染色液，干燥后拍照；或在顯微鏡下，計(jì)數(shù)每孔大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率；克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)［21］

將A549細(xì)胞與NRF2 sgRNA-2敲除細(xì)胞鋪至6孔板，6孔板在加入培養(yǎng)液之前先用Mark筆在板下劃3～5條等距直線，待次日細(xì)胞數(shù)量達(dá)到95%時(shí)，取出6孔板，倒掉培液，選擇10 μL的移液器吸嘴用直尺比著開始劃痕，每個(gè)孔里可以多劃幾道傷痕，PBS洗3遍，加入無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別在0、24和48 h時(shí)在倒置顯微鏡下進(jìn)行定點(diǎn)拍照即可。

1.2.8 細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)［21］

將200 μL無(wú)血清細(xì)胞懸液（含3×104個(gè)細(xì)胞）接種到上室，在下室加入含10%FBS的培液、37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽將上室細(xì)胞擦拭干凈，預(yù)冷甲醇液固定10 min，棄掉甲醇PBS洗2遍，結(jié)晶紫染色20 min，緩慢沖洗干凈染色液，干燥后顯微鏡下拍照即可。

1.2.9 CCK-8檢測(cè)［22］

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪至96孔板，每孔鋪5×103個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞完全貼壁后，每100 μL培液中加入10 μL的CCK-8試劑，放置培養(yǎng)箱中溫育3 h，酶標(biāo)儀下檢測(cè)吸光值（D）值，棄去CCK-8換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)養(yǎng)，以此類推，分別檢測(cè)在24、48和72 h的D值即可。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

將sgRNA退火連接到載體pLenti CRISPR v2上，轉(zhuǎn)化后挑單克隆抽質(zhì)粒，然后送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序驗(yàn)證靶序列正確插入載體，黑色方框框住的序列即為靶序列（圖1）。

2.2 NRF2純合子敲除細(xì)胞株

將pLenti CRISPR v2-NRF2 sgRNA-F/R兩個(gè)質(zhì)粒通過包裝慢病毒的方式共同轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞株中，有限稀釋法挑選單克隆細(xì)胞株，提取DNA后PCR擴(kuò)增目的片段，最后送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序驗(yàn)證敲除，根據(jù)測(cè)序結(jié)果挑選純合子，本次實(shí)驗(yàn)挑選出了3株純合敲除細(xì)胞，分別命名為NRF2 sgRNA-1、NRF2 sgRNA-2和NRF2 sgRNA-3。測(cè)序結(jié)果顯示3種不同的編輯方式的確在靶序列部位部分敲除（圖2）。

圖1 靶序列插入質(zhì)粒測(cè)序圖Fig.1 Target sequences on plasmid sequencing maps

圖2 3株純合子敲除細(xì)胞株基因編輯方式Fig.2 Gene editing methods for 3 homozygous knockout cell lines

2.3 NRF2基因及其下游HO-1蛋白水平

3株純合子敲除細(xì)胞進(jìn)行NRF2蛋白表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果顯示NRF2基因確被敲除。與A549細(xì)胞相比較，NRF2及其下游靶基因HO-1（血紅素加氧酶-1）抗氧化酶的蛋白水平顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證NRF2敲除成功（圖3）。

圖3 3株NRF2純合敲除的A549細(xì)胞蛋白水平結(jié)果顯示NRF2及其下游靶基因HO-1表達(dá)顯著降低Fig.3 The results showed that the expressions of NRF2 and its downstream target gene HO-1 were significantly decreased in 3 NRF2 homozygous knockout A549 cells

2.4 NRF2及其下游靶基因mRNA表達(dá)水平

與A549細(xì)胞相比較，NRF2敲除后其自身及下游靶基因HMOX1、HO-1、GCLC、NQO1、FTH1 mRNA表達(dá)都明顯下降，說明bzip區(qū)域的敲除確實(shí)可以阻斷NRF2與ARE的結(jié)合，從而抑制下游靶基因的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)方法采用未配對(duì)t檢驗(yàn)（圖4）。

2.5 NRF2敲除細(xì)胞系增殖能力

通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，可以觀察到與A549細(xì)胞相比較，NRF2敲除細(xì)胞增殖能力明顯低于未敲除細(xì)胞，表明NRF2在肺癌發(fā)展中起重要作用（圖5）。

2.6 NRF2敲除細(xì)胞系增殖能力

圖4 NRF2敲除細(xì)胞株與A549細(xì)胞株之間NRF2下游靶基因表達(dá)的比較Fig.4 Comparison of NRF2 downstream target gene expression between NRF2 knockout cell line and A549 cell line

圖5 A549與NRF2 sgRNA-2細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)Fig.5 Comparison of the ability of A549 to differentiate into NRF2 sgRNA-2 cell plate clones

通過CCK-8實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)及增殖能力，可以觀察到隨著時(shí)間增長(zhǎng)，NRF2敲除細(xì)胞的D值明顯低于未敲除細(xì)胞，D值的大小與活細(xì)胞數(shù)成正比（圖6）。

2.7 NRF2敲除細(xì)胞系遷移能力

通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以觀察到隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NRF2敲除細(xì)胞系傷痕愈合即遷移能力明顯低于A549細(xì)胞，充分證明A549細(xì)胞NRF2基因敲除后會(huì)明顯降低腫瘤細(xì)胞的遷移能力（圖7）。

2.8 NRF2敲除細(xì)胞系侵襲能力

采用Transwell法比較細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，NRF2敲除后A549細(xì)胞的侵襲能力較親本A549細(xì)胞顯著減低，表明NRF2基因敲除可以使A549肺癌細(xì)胞的侵襲能力下降（圖8）。

圖6 A549、NRF2 sgRNA-2細(xì)胞加入CCK-8試劑后0、24、48和72 h的D值折線圖Fig.6 Line diagram of D values at 0,24,48 and 72 h after CCK-8 reagent was added to A549 and NRF2 sgRNA-2 cells

圖7 A549與NRF2 sgRNA-2細(xì)胞株遷移能力的比較Fig.7 Comparison of migration ability between A549 and NRF2 sgRNA-2 cell lines

圖8 A549與NRF2 sgRNA-2細(xì)胞之間侵襲能力的比較Fig.8 Comparison of invasive ability between A549 and NRF2 sgRNA-2 cells

3 討 論

近年來，CRISPR/Cas9成為科研領(lǐng)域一項(xiàng)很熱門的技術(shù)，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便，成本低、效率高且可同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)編輯等優(yōu)勢(shì)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以快速方便地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)基因組編輯［23-25］。除此之外，該基因編輯技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病治療方面也有所進(jìn)展［26-27］。此外，本次實(shí)驗(yàn)利用慢病毒表達(dá)載體，具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，可為后續(xù)其他功能研究帶來方便。

NRF2基因已被證明在很多腫瘤中攜帶有突變或高表達(dá)狀態(tài)，NRF2的表達(dá)和活性增強(qiáng)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及預(yù)后等相關(guān)［28］。本實(shí)驗(yàn)選取的人A549肺癌細(xì)胞本身攜帶有KEAP1基因G333C突變，且NRF2基因高表達(dá)［29］。我們選擇利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)NRF2基因?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定敲除。在NRF2基因7個(gè)Neh高度保守序列中，我們選擇針對(duì)Neh1區(qū)域的CNC-bzip結(jié)構(gòu)上下游設(shè)計(jì)一對(duì)sgRNA。Neh1區(qū)域包括CNC-bZIP區(qū)域，該區(qū)域是DNA結(jié)合和NRF2與sMaf蛋白結(jié)合形成二聚體所必需的區(qū)域［30］。故該結(jié)構(gòu)被敲除后，NRF2與下游靶基因的抗氧化元件ARE結(jié)合能力顯著降低，導(dǎo)致各類抗氧化基因、藥物解毒相關(guān)基因等蛋白水平及mRNA表達(dá)也受到抑制。有研究報(bào)道，A549肺癌細(xì)胞NRF2基因敲除在體外移植瘤實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)表型即表現(xiàn)為增殖減慢，而且聯(lián)合卡鉑、順鉑等化療藥物能更明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)［20］。與我們體外功能研究結(jié)果相一致，克隆形成、CCK-8、細(xì)胞劃痕、Transwell等實(shí)驗(yàn)也證明NRF2基因敲除后細(xì)胞的增殖能力、遷移能力、侵襲能力都顯著降低。

利用CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)獲得高效永久NRF2基因敲除肺癌細(xì)胞系，且NRF2基因敲除后A549肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力都顯著降低。