鐘 鍵，金正賢，卞衛(wèi)星，仇佳星，侯建全

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)張家港附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 蘇州 215600；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇 蘇州 215006

膀胱癌是泌尿外科常見(jiàn)的腫瘤之一，90%的膀胱癌是移行細(xì)胞癌，呈乳頭狀，術(shù)后易復(fù)發(fā)，但很少發(fā)展到浸潤(rùn)性腫瘤，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3）和磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基ɑ（phosphoinositide 3 kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA）基因突變?cè)跍\表乳頭狀膀胱腫瘤中常見(jiàn)，并且FGFR3基因突變預(yù)后更好，但易復(fù)發(fā)［1］。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展不僅有PI3K/AKT信號(hào)通路的參與，也有上游調(diào)節(jié)因子FGFR3的參與［2］。因此本研究對(duì)膀胱癌患者的膀胱癌組織進(jìn)行FGFR3和PIK3CA基因突變和蛋白表達(dá)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

2014年2月—2017年12月于南京中醫(yī)藥大學(xué)張家港附屬醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療的63例膀胱癌患者，均為移行細(xì)胞癌，男性53例，女性10例，吸煙史52例，低級(jí)別尿路上皮癌41例，高級(jí)別尿上皮癌22例，根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)的2002年第6版TNM分期法，TaN0M0期27例，T1N0M0期8例，T2aN0M0期16例，T2bN0M0期8例，T3aN0M0期3例，T3bN0M0期1例，無(wú)T4期病例。術(shù)前均未進(jìn)行放化療和免疫治療。經(jīng)尿道膀胱腫瘤等離子電切術(shù)44例，術(shù)后均予以吡柔比星40 mg（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司）膀胱灌注，共19次，定期復(fù)查膀胱鏡和胸腹部CT。根治性膀胱切除+尿流改道術(shù)19例，術(shù)后予以4個(gè)療程的GC方案（吉西他濱+順鉑）化療，定期復(fù)查胸腹部CT。所有標(biāo)本在進(jìn)行研究前由南京中醫(yī)藥大學(xué)張家港附屬醫(yī)院病理科2名主任醫(yī)師職稱(chēng)的病理科醫(yī)師再次閱片確診，保證病理學(xué)診斷的一致性，剔除診斷不一致的病例。

1.2 隨訪(fǎng)

全組患者的隨訪(fǎng)起點(diǎn)為手術(shù)開(kāi)始時(shí)，隨訪(fǎng)終點(diǎn)為2018年3月31日。復(fù)發(fā)指臨床及影像學(xué)檢查顯示膀胱內(nèi)再發(fā)腫瘤。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移指臨床及影像學(xué)檢查顯示有遠(yuǎn)處相關(guān)疾病。無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）指從手術(shù)后的第1天開(kāi)始至第1次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間，總生存期（overall survival，OS）指從手術(shù)后的第1天開(kāi)始至死亡或末次隨訪(fǎng)的時(shí)間，刪截點(diǎn)包括：①死于其他疾病；② 失訪(fǎng)等事件。時(shí)間以月為單位，隨訪(fǎng)期間因膀胱癌死亡6例，1例死于急性心肌梗死，1例失訪(fǎng)。本研究獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)張家港附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 免疫組織化學(xué)

術(shù)后取新鮮腫瘤組織，10%中性福爾馬林溶液固定24 h，采用5 μm厚的蠟塊連續(xù)組織切片，1張做蘇木精-伊紅染色以核實(shí)診斷，另1張做FGFR3免疫組織化學(xué)染色，1張PBS做一抗空白對(duì)照。FGFR3和PIK3CA單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。FGFR3和PIK3CA一抗均為工作液，稀釋濃度分布為1∶50和1∶100，經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水、透明后封片。

蛋白表達(dá)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：FGFR3蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為黃色或棕黃色著色。將每張免疫組織化學(xué)切片置于高倍鏡下（×400），隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)黃色或棕黃色著色即為陽(yáng)性蛋白表達(dá)，無(wú)著色為陰性。

1.4 突變檢測(cè)

從每例包埋石蠟組織塊中切取組織，采用OMEGA試劑盒法分離和提取組織DNA，采用定量分析法評(píng)價(jià)DNA的質(zhì)量，直到提取DNA的質(zhì)量合格。以FGFR3基因熱點(diǎn)突變外顯子7、10和15為模板設(shè)計(jì)引物，PIK3CA基因熱點(diǎn)突變外顯子9和20為模板設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增DNA（20.00 μL PCR擴(kuò)增體系：1.00 μL腫瘤DNA，0.15 μL Taq高保真酶，引物0.80 μL，dNTP 0.80 μL，Mg2+0.80 mL，ddH2O 14.45 μL，10×buffer 2.00 μL）。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性7.0 min，94 ℃變性1.0 min，62 ℃退火1.5 min（外顯子15）和61 ℃退火1.5 min（外顯子7和10），72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，采用Sanger基因測(cè)序技術(shù)對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，利用Chromas軟件進(jìn)行基因突變判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。OS和PFS用Kaplan-Meier曲線(xiàn)及l(fā)og-rank檢驗(yàn)分析，多參數(shù)COX回歸分析影響膀胱癌預(yù)后因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪(fǎng)及突變檢測(cè)結(jié)果

63例膀胱癌患者中，術(shù)后13例復(fù)發(fā)，11例FGFR3基因突變（17.46%），蛋白表達(dá)21例（33.33%），5例PIK3CA基因突變（7.94%），蛋白表達(dá)35例（55.56%）。

2.2 FGFR3和PIK3CA基因突變與臨床各參數(shù)的關(guān)系

FGFR3基因突變與性別、吸煙史、腫瘤大小、數(shù)目、分期、分級(jí)無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），而FGFR3基因突變與年齡、術(shù)后腫瘤是否復(fù)發(fā)顯著相關(guān)（P＜0.05，表1）。PIK3CA基因突變與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、數(shù)目、分期分級(jí)、腫瘤復(fù)發(fā)均無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05，表1）。

表1 FGFR3和PIK3CA基因突變與臨床各參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relationship between clinical data and mutations of FGFR3 and PIK3CA

2.3 FGFR3和PIK3CA基因突變的關(guān)系

FGFR3mut/PIK3CAwt組基因突變?cè)诟鞣纸M中分別為3例、2例、4例，F(xiàn)GFR3mut/PIK3CAmut組基因突變?cè)趐Ta/T1low組中為2例，F(xiàn)GFR3wt/PIK3CAmut組基因突變?cè)趐Ta/T1high和≥T2組中分別為1例和2例。FGFR3mut和PIK3CAmut單基因突變12例（19.05%），聯(lián)合突變2例（3.17%）。11例FGFR3mut中2例PIK3CAmut，52例FGFR3wt中3例PIK3CAmut，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.61，P=0.03，表2）。

表2 FGFR3和PIK3CA基因突變的關(guān)系Tab.2 The relationship between FGFR3 and PIK3CA mutations

2.4 FGFR3和PIK3CA基因突變對(duì)OS和PFS的影響

FGFR3mut和FGFR3wt的OS分別為47.00和48.26個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.675，圖1A）；FGFR3mut和FGFR3wt的PFS分別為29.13和46.25個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021，圖1B）。PIK3CAmut和PIK3CAwt的OS分別為32.00和26.07個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.435，圖2A），PIK3CAmut和PIK3CAwt的PFS分別為28.67和26.32個(gè)月，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.204，圖2B）。

圖1 FGFR3基因突變型和野生型OS和PFS的Kaplan-Meier曲線(xiàn)Fig.l The Kaplan-Meier curves of OS and PFS for patients with mutant and wild-tye FGFR3

圖2 PIK3CA基因突變型和野生型OSF和PFS的Kaplan-Meier曲線(xiàn)Fig.2 The Kaplan-Meier curves of OS and PFS for patients with mutant and wild-tye PIK3CA

2.5 多參數(shù)COX回歸分析影響膀胱癌的OS和PFS的因素

COX多參數(shù)分析影響膀胱癌預(yù)后的因素，病理學(xué)分級(jí)是影響膀胱癌預(yù)后OS的危險(xiǎn)因素，F(xiàn)GFR3和PIK3CA基因突變和蛋白表達(dá)均不是影響OS的獨(dú)立因素（表3）；吸煙史和FGFR3基因突變則是影響膀胱癌患者預(yù)后PFS的危險(xiǎn)因素（表4）。

表3 多參數(shù)COX回歸分析影響膀胱癌OS的因素Tab.3 A multivariate analysis for the prognostic factors of OS in bladder cancer

表4 多參數(shù)COX回歸分析影響膀胱癌PFS的因素Tab.4 A multivariate analysis for the prognostic factors of PFS in bladder cancer

3 討 論

膀胱癌是全球第10位常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率正隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展而逐年增加，但死亡率卻逐年降低，并且全球排名也在不斷下降，主要是由于其他惡性腫瘤快速增長(zhǎng)，如前列腺癌和乳癌等［3-4］。膀胱癌多見(jiàn)于男性，男性發(fā)病率是女性的4倍，除暴露于化學(xué)和污染因素外，吸煙是最主要的危險(xiǎn)因素。約30%的初發(fā)膀胱癌進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌而行根治術(shù)，然而術(shù)后2年約50%的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移［5］。雖然基于順鉑的新輔助化療能更好地控制腫瘤和提高總生存率［6］，但迄今為止，還沒(méi)有生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展，大多數(shù)采用臨床癥狀聯(lián)合影像學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估療效。因此，需要可靠的標(biāo)志物來(lái)評(píng)估腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而越來(lái)越多的證據(jù)表明，膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展是由基因改變累積到質(zhì)變而發(fā)生。目前，歐美研究者認(rèn)為FGFR3基因突變與低級(jí)別低分期膀胱癌有關(guān)［1］，并在腫瘤進(jìn)展的早期也可發(fā)生基因突變，而PIK3CA基因突變激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞癌變［7］，但國(guó)內(nèi)尚缺乏相應(yīng)的研究，因此，本課題組在膀胱癌中進(jìn)行了初步研究。

FGFR3是酪氨酸激酶受體基因家族成員之一，F(xiàn)GFR3基因突變和受體功能異常，引起機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育異常，導(dǎo)致人體軟骨發(fā)育不良等多種人類(lèi)遺傳性疾病。FGFR3基因編碼酪氨酸激酶連接的細(xì)胞表面受體，基因突變導(dǎo)致受體組成性激活［8］。在低級(jí)別低分期膀胱癌中突變率達(dá)80%，在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中，突變率僅為10%～15%，在原位癌中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變［9］。在本研究中，F(xiàn)GFR3基因突變率僅為17.46%，低于文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)可能與種族、檢測(cè)方法、標(biāo)本類(lèi)型有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3基因突變與年齡、腫瘤是否復(fù)發(fā)相關(guān)，提示高齡膀胱癌患者，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)活躍，但機(jī)體抵抗力低，即使術(shù)后輔助化療，仍易復(fù)發(fā)。雖然FGFR3基因突變多見(jiàn)于低級(jí)別低分期膀胱癌，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與種族和樣本量等有關(guān)。因此需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心研究。

PIK3CA基因是磷脂酰肌醇激酶-3家族關(guān)鍵的成員之一，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與細(xì)胞的增殖、黏附、分化、遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)［10］。PIK3CA基因突變導(dǎo)致PIK3CA蛋白過(guò)度表達(dá)，PI3K催化活性增強(qiáng)，PI3K/AKT信號(hào)通路異常激活，促進(jìn)細(xì)胞癌變而腫瘤形成［11］。因此，PIK3CA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，是理想的治療靶點(diǎn)。PIK3CA基因突變率在歐美人群中為13%～25%［12］，并且隨著分級(jí)分期的增加，突變率降低。在本研究中僅為7.94%，可能與種族差異、群體多樣性、檢測(cè)方法等有關(guān)。PIK3CA基因突變隨著腫瘤分級(jí)和分期的增加而降低，并且認(rèn)為PIK3CA基因突變發(fā)生在膀胱癌的早期［13］，然而本研究顯示，PIK3CA基因突變與腫瘤分級(jí)和分期等無(wú)關(guān)，提示PIK3CA在膀胱癌的發(fā)病機(jī)制中不扮演重要角色，與Juanpere等［14］的報(bào)道一致，PI3K信號(hào)通路通過(guò)不同的分子機(jī)制促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展［15］。本研究顯示，在FGFR3基因突變型和野生型的膀胱癌中，PIK3CA基因突變更多見(jiàn)于FGFR3基因突變型膀胱癌，PIK3CA基因突變與FGFR3基因突變密切相關(guān)［14］。PI3K信號(hào)通路的激活有助于增強(qiáng)FGFR3突變型膀胱癌的惡性行為［1］，為聯(lián)合靶向FGFR3-PI3K治療膀胱癌奠定了基礎(chǔ)［16］，雖然PI3K/AKT信號(hào)通路在膀胱癌中處于失調(diào)狀態(tài)，但其不是膀胱癌的主要發(fā)病機(jī)制。

影響膀胱癌預(yù)后的因素很多，如腫瘤因素、手術(shù)因素、輔助治療等，而FGFR3和PIK3CA基因突變對(duì)膀胱癌的預(yù)后預(yù)測(cè)作用仍然有爭(zhēng)議。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)GFR3基因突變的膀胱癌預(yù)后更好［17］，甚至FGFR3基因突變能預(yù)測(cè)肌層浸潤(rùn)性膀胱癌術(shù)前新輔助化療的療效［18］，而Geelvink等［19］認(rèn)為FGFR3基因突變不能預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展等風(fēng)險(xiǎn)。PIK3CA基因突變的預(yù)后作用根據(jù)實(shí)體腫瘤的不同而不同，在結(jié)直腸癌或肺癌患者中預(yù)后不良［20-21］，而在食管癌或卵巢癌患者中則預(yù)后較好［22］，但在膀胱癌中則需要聯(lián)合FGFR3才能評(píng)估PIK3CA的預(yù)后價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，病理學(xué)分級(jí)是影響膀胱癌OS的主要因素，而FGFR3和PIK3CA基因突變和蛋白表達(dá)并不是影響OS的主要因素。FGFR3基因突變和吸煙史則是影響PFS的主要因素，而且根據(jù)Kaplan-Meier生存分析，F(xiàn)GFR3基因突變的膀胱癌PFS更短，本研究顯示，F(xiàn)GFR3基因突變是膀胱癌預(yù)后的一個(gè)不利因素，可將FGFR3基因突變作為膀胱癌高危因素分層的生物標(biāo)志物，因此FGFR3基因突變的膀胱癌應(yīng)該采用更加積極的治療策略，術(shù)后應(yīng)該縮短復(fù)查間隔時(shí)間［23］。相同的研究得出了不同的結(jié)果，可能是由于患者隊(duì)列、樣本大小、用于評(píng)估突變的方法或種族差異，因此仍然值得我們進(jìn)行深入的研究。

因此，F(xiàn)GFR3基因突變是膀胱癌預(yù)后的不利因素，PIK3CA更易在FGFR3突變的膀胱癌中突變，可能促進(jìn)FGFR3突變型膀胱癌的惡性行為。