焦志凱，馮寧寧，張?jiān)缴剑?希，楊寶明，李建坤，曹 恒，董 彪，付炯輝，王順祥

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊 050011

胰腺癌是中國常見的惡性程度較高的消化道惡性腫瘤之一，危害極大［1-2］。因此，探索胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對于疾病防治具有重要的臨床意義。miRNA是由18～22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，能夠與靶基因3'非編碼區(qū)特異性結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在腫瘤組織中異常表達(dá)［3-4］。其中miR-762已被證實(shí)在乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，通過調(diào)控靶基因表達(dá)參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等過程［5-6］。但miR-762在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用報(bào)道較少。本研究檢測了miR-762在胰腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并分析了miR-762在胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本及細(xì)胞株

收集2016年1月—2019年1月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行胰腺癌根治術(shù)的胰腺癌組織標(biāo)本35例（包括癌組織及距離其3～5 cm的癌旁組織），術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且術(shù)前未接受放化療。人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3、PANC-1、AsPC-1、SW-1990和人正常胰腺上皮細(xì)胞HPDE購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、TRIzol購自美國Gibco公司；miR-762模擬物（mimics）、miR-762抑制物（inhibitors）及其陰性對照序列（scramble序列）購自上海吉凱制藥技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）抗體購自美國Abcam公司。Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；7300型RTFQ-PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合達(dá)80%時采用LipofectamineTM2000將miR-762 mimics、miR-762 inhibitors及其scramble序列分別轉(zhuǎn)染至PANC-1細(xì)胞中，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性

細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，以2×103個/孔的密度接種于96孔板，每孔200 μL。分別于培養(yǎng)0、1、2、3、4 d時進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測定450 nm處的吸光度（D450）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，加入Annexin V和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5 μL，37 ℃避光染色20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

轉(zhuǎn)染48 h后，各組細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合達(dá)100%時用10 μL槍頭在培養(yǎng)板底部做一均勻劃痕，PBS洗滌3次，加入含2%FBS的新鮮培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察劃痕后即刻、48 h時的細(xì)胞遷移情況，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（劃痕后即刻劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/劃痕后即刻劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，取200 μL接種到預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室，下室加入200 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用棉簽刮去基質(zhì)膠和未穿膜細(xì)胞，多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，求平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 RTFQ-PCR檢測基因mRNA

TRIzol提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。取2 μL cDNA為模板，在ABI 7300型RTFQ-PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。U6為內(nèi)參照基因，采用2-△△CT法定量目的基因mRNA相對表達(dá)量。miR-762及U6引物序列如下：miR-762上游引物5'-ACACGGGGCUGGGGCCGG GGCCGAGCGCCTC-3'，下游引物5'-CTCAGG GGCUGGGGCCGGGGCCGAGCCAGA-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。E-cadherin、N-cadherin、vimentin及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因引物序列如下：E-cadherin上游引物5'-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3'，下游引物5'-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3'；N-cadherin上游引物5'-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3'，下游引物5'-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3'；Vimentin上游引物5'-GAGA ACTTTGCCGT TGAAGC-3'，下游引物5'-GCTTCCTGTAGGTG GCAATC-3'；GAPDH上游引物5'-CTCTGCTCCT CCTGTTCGAC-3'，下游引物5'-GCGCCCAA TACGACCAAATC-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，S D S-PA G E）分離后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，10%脫脂奶粉封閉2.0 h，加入特異性一抗溫育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫溫育1.5 h，TBST洗膜3次。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影，設(shè)GAPDH為內(nèi)參照蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-762在胰腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)

RTFQ-PCR結(jié)果顯示，胰腺癌組織中miR-762 mRNA表達(dá)量為0.91±0.28，顯著高于癌旁組織（0.32±0.08）（t=12.30，P=0.000）。胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3、PANC-1、AsPC-1、SW-1990中miR-762 mRNA的表達(dá)量分別為0.57±0.08、1.22±0.32、0.79±0.21、0.96±0.11，顯著高于正常胰腺上皮細(xì)胞HPDE（0.31±0.08）（t=-4.61、-6.04、-4.67、12.03，P=0.010、0.004、0.010、0.000，圖1）。

圖1 miR-762在胰腺癌和正常胰腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-762 in pancreatic cancer and normal pancreatic epithelial cell lines

2.2 轉(zhuǎn)染miR-762 mimics、miR-762 inhibitors對PANC-1細(xì)胞miR-762表達(dá)的影響

RTFQ-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，空白對照組、陰性對照組、miR-762 mimics組、miR-762 inhibitors組miR-762 mRNA表達(dá)量分別為1.16±0.21、1.12±0.24、9.45±1.23、0.39±0.10。與陰性對照組比較，miR-762 mimics 組miR-762 mRNA表達(dá)量顯著增加，miR-762 inhibitors組miR-762 mRNA表達(dá)量顯著降低（t=-13.70、5.10，P=0.000、0.007，圖2）。

2.3 miR-762對PANC-1細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后第2～4天，與陰性對照組比較，miR-762 mimics組D450顯著增加，miR-762 inhibitors組D450顯著降低（P＜0.01，圖3）。

圖3 miR-762對PANC-1細(xì)胞增殖的影響（CCK-8實(shí)驗(yàn)）Fig.3 Effect of miR-762 on proliferation of PANC-1 cells (CCK-8 assay)

2.4 miR-762對PANC-1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，空白對照組、陰性對照組、miR-762 mimics組、miR-762 inhibitors組細(xì)胞凋亡率分別為（10.15±2.43）%、（10.00±1.95）%、（3.40±0.77）%、（22.64±3.71）%。與陰性對照組比較，miR-762 mimics組細(xì)胞凋亡率顯著降低，miR-762 inhibitors組細(xì)胞凋亡率顯著增加（t=7.95、-7.41，P=0.001、0.002，圖4）。

圖4 miR-762對PANC-1細(xì)胞凋亡的影響（流式細(xì)胞術(shù)）Fig.4 Effect of miR-762 on apoptosis of PANC-1 cells (flow cytometry)

2.5 miR-762對PANC-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，空白對照組、陰性對照組、miR-762 mimics組、miR-762 inhibitors組細(xì)胞遷移距離分別為（1.04±0.27）μ m、（1.00±0.24）μ m、（1.79±0.16）μm、（0.34±0.10）μm。與陰性對照組比較，miR-762 mimics組細(xì)胞遷移距離顯著延長，miR-762 inhibitors組細(xì)胞遷移距離顯著縮短（t=-11.29、7.68，P=0.000、0.002）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，空白對照組、陰性對照組、miR-762 mimics組、miR-762 inhibitors組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（196.40±25.13）個、（188.20±26.04）個、（279.40±20.31）個、（92.80±11.08）個。與陰性對照組比較，miR-762 mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，miR-762 inhibitors組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（t=-4.91、6.67，P=0.008、0.003，圖5）。

圖5 miR-762對PANC-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響Fig.5 Effect of miR-762 on invasion and migration of PANC-1 cells

2.6 miR-762對PANC-1細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）相關(guān)標(biāo)志物的影響

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，與陰性對照組比較，miR-762 mimics組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量明顯降低，間質(zhì)表型細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、vimentin表達(dá)量明顯增加（t=7.87、-6.11、-4.53，P=0.001、0.004、0.011）；而miR-762 inhibitors組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量明顯增加，間質(zhì)表型細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、vimentin表達(dá)量明顯降低（t=4.13、5.31、6.78，P=0.014、0.006、0.002，圖6）。

圖6 Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of EMT-associated proteins detected by Western blot

3 討 論

胰腺癌預(yù)后極差，與其早期易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA表達(dá)失調(diào)在胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用［8-10］。因此，尋找與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的miRNA具有積極意義。miR-762與腫瘤關(guān)系密切，Hou等［5］發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織高表達(dá)miR-762，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，還發(fā)現(xiàn)抑癌基因menin是其下游靶基因。Li等［6］也證實(shí)乳腺癌組織和細(xì)胞株高表達(dá)miR-762，可靶向下調(diào)IRF7基因表達(dá)。但miR-762在調(diào)控胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明，胰腺癌組織及4種胰腺癌細(xì)胞株中miR-762呈高表達(dá)，提示miR-762可能參與了胰腺癌的形成及進(jìn)展。在此基礎(chǔ)上，本研究采用基因干擾技術(shù)在胰腺癌PANC-1細(xì)胞中過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-762，并采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測調(diào)節(jié)miR-762表達(dá)對PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-762表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)PANC-1細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，并抑制其凋亡；相反，下調(diào)miR-762表達(dá)能夠顯著抑制PANC-1細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，并促進(jìn)其凋亡。

EMT是腫瘤耐藥、干細(xì)胞樣特性形成及獲得更高惡性程度的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11-14］。在此過程中，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)量降低，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、vimentin表達(dá)量升高。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)miR-762能夠顯著上調(diào)胰腺癌細(xì)胞N-cadherin、vimentin表達(dá)，下調(diào)E-cadherin表達(dá)；而抑制miR-762表達(dá)能夠顯著下調(diào)胰腺癌細(xì)胞N-cadherin、vimentin表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，證實(shí)miR-762可能參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程。

綜上所述，miR-762在胰腺癌組織和細(xì)胞株中異常高表達(dá)，通過影響EMT進(jìn)程促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，提示miR-762有可能成為胰腺癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。然而，miR-762調(diào)控胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體靶點(diǎn)仍需深入研究。