鄭夏穎，陳俊霞

重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，重慶 400016

乳腺癌是全世界最常見的婦女惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤發(fā)病率第1位［1］。隨著分子生物學(xué)及基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，乳腺癌的分子分型不斷完善，目前乳腺癌廣泛使用的標(biāo)準(zhǔn)是2013年St.Gallen乳腺癌國際會議上規(guī)定的乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)，分為Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過表達(dá)型、基底樣型/三陰性型及其他特殊類型乳腺癌［2］。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和HER2均為陰性的一類乳腺癌，與其他亞型乳腺癌相比，惡性程度更高，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移［3］。TNBC是一類異質(zhì)性極高的惡性腫瘤，目前的治療方式以化療為主，尚缺乏有效的靶向治療，因此亟待尋找診斷和治療TNBC的新的生物標(biāo)志物和靶分子。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不含5'端帽子和3'端多聚腺苷酸尾巴［4］。研究表明，circRNA在包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［5-7］，但目前有關(guān)circRNA在TNBC中的功能及其機(jī)制的報(bào)道尚少。本研究旨在探討hsa_circ_0005320在TNBC中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本

本研究中的20例未接受放療或化療的TNBC組織及癌旁組織由重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心保存。該組織樣本來自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，20例患者（均為女性）均簽署知情同意書后進(jìn)行手術(shù)切除，樣本通過病理學(xué)檢查證實(shí)并立即放于液氮中。臨床資料和人TNBC標(biāo)本的收集由重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會授權(quán)和監(jiān)督。

1.1.2 細(xì)胞系及主要試劑

正常人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A和人TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231和BT-549）購自美國ATCC細(xì)胞庫。siRNA-陰性對照（siRNAnegative control，si-NC）和si-circ（si-hsa_circ_0005320）質(zhì)粒及hsa_circ_0005320探針由廣州吉賽生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)合成；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；MEBM培養(yǎng)基套裝購自瑞士Lonza公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自重慶博全生物科技有限公司；TRIzol、PrimeScript RT Reagent Kit和TB Green購自日本Takara公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物購自武漢金開瑞生物工程有限公司；Cell-LightTM EdU Apollo567In VitroKit購自廣州銳博生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自武漢博士德生物工程有限公司；Hoechst 33342試劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Tunel一步法測凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-LIF抗體購自美國R&D公司，Anti-STAT3抗體購自英國Abcam公司，Anti-P-STAT3抗體購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA測序

通過收集4對TNBC組織及癌旁組織，對其進(jìn)行總RNA的提取并檢測總RNA的質(zhì)量和總RNA的完整度，質(zhì)檢合格后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在廣州吉賽生物科技股份有限公司進(jìn)行RNA測序（構(gòu)建RNA測序文庫、上機(jī)測序以及差異基因分析），根據(jù)測序結(jié)果篩選出TNBC組織及癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA，并使用微陣列對包括hsa_circ_0005320在內(nèi)具有明顯差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行聚類分析。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A使用MEBM培養(yǎng)基，TNBC細(xì)胞（MDA-MB-231和BT-549）分別在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，三株細(xì)胞均在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每間隔1～2 d更換新培養(yǎng)基。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，采用LipofectamineTM2000分別將si-NC和si-circ轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞或BT-549細(xì)胞中，24、48 h后收獲細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測hsa_circ_0005320的表達(dá)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，按照說明書用TRIzol法提取TNBC組織和癌旁組織、正常人乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）和TNBC細(xì)胞（MDA-MB-231和BT-549）總RNA，瓊脂糖凝膠電泳判斷提取RNA的完整性，酶標(biāo)儀檢測其濃度和純度。利用PrimeScript RT Reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用美國Bio-Rad公司的RTFQ-PCR儀檢測hsa_circ_0005320在TNBC組織和細(xì)胞中的相對表達(dá)水平。該研究所用特異性引物如下。GAPDH上游引物序列：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'；hsa_ci rc_00 05320上游引物序列：5'-TTG G AGAATTCAGAGCCTG-3'，下游引物序列：5'-AAGATCTTTTCAAGGCCTCC-3'。以GAPDH為內(nèi)參，cDNA為模板，在95 ℃預(yù)變性3 min；然后在95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s的條件下擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，hsa_circ_0005320的相對表達(dá)量采用2-△△CT法表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）實(shí)驗(yàn)檢測hsa_circ_0005320的表達(dá)

將TNBC與癌旁組織經(jīng)冰凍切片制備成8 μm厚度的組織切片。在0.2 mol/L HCl中室溫處理15 min，0.25%胃蛋白酶37 ℃溫育30 min，并用4%多聚甲醛固定20 min，然后加入雜交液55 ℃溫育2 h；將探針與雜交液按1∶200的比例稀釋，于PCR儀上85 ℃ 2 min變性，37 ℃2 min平衡后加入探針37℃避光溫育過夜；加入DAPI復(fù)染20 min，抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡下拍照。hsa_circ_0005320探針序列為5'-AGATCTTTTCAAGGCCTCCTGGCT-3'。

1.2.5 EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

接種至24孔板的各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，2 mg/mL甘氨酸脫色搖床溫育5 min，0.5%TritonX-100脫色搖床溫育10 min，然后根據(jù)Cell-LightTM EdU Apollo567In VitroKit試劑盒說明書對細(xì)胞進(jìn)行Apollo染色及DNA染色，經(jīng)抗熒光淬滅劑封片后置于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞或BT-549細(xì)胞24 h后，將各組細(xì)胞制備成100 μL的細(xì)胞懸液（密度為1×104/mL）接種到96孔板，置于溫箱37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液并混勻，然后將細(xì)胞放入溫箱溫育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（D）值，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

MDA-MB-231細(xì)胞或BT-549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化細(xì)胞并用PBS洗3次，1 000 r/min離心5 min后棄上清，用Annexin結(jié)合液重懸細(xì)胞，每組再加入10 μL的Annexin V-PE室溫避光溫育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.8 Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡

接種至24孔板的各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用4%多聚甲醛固定1 h，經(jīng)Hoechst 33342染色10 min，抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡下拍照。

1.2.9 Tunel實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡

24孔板中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染至48 h后，4%多聚甲醛固定1 h，經(jīng)0.1%TritonX-100冰上溫育2 min，根據(jù)Tunel一步法測凋亡試劑盒配制Tunel檢測液并于37 ℃下避光溫育1 h，使用抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡率并拍照。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞或BT-549細(xì)胞48 h后，PBS洗3次，1 000 r/min離心5 min后棄上清，70%乙醇輕柔重懸后4 ℃固定過夜。1 000 r/min離心5 min后去除乙醇，PBS洗3次，每組加入0.5 mL的PI溶液（50 μg/mL）室溫避光溫育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.11 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá)

收集6孔板中轉(zhuǎn)染48 h后的MDA-MB-231或BT-549各組細(xì)胞，每組加入100 μL RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）后提取各組細(xì)胞總蛋白，每孔按30 μg蛋白進(jìn)行上樣。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）恒壓80 V電泳分離，再冰浴恒流200 mA轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在5%脫脂奶粉中常溫?fù)u床封閉2 h，然后4 ℃溫育一抗（兔抗GAPDH 1∶5 000，STAT31∶1 000，P-STAT31∶1 000，羊抗LIF 1∶1 000）過夜，在37 ℃溫育二抗（1∶5 000）2 h，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光顯色，在Bio-Rad凝膠成像儀內(nèi)拍照，并用Quantity One對圖像進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0005320在TNBC組織和細(xì)胞中高表達(dá)

通過RNA-Seq測序，在4對TNBC組織和癌旁組織中共檢測到354個(gè)差異表達(dá)的circRNA（其中47個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)，307個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)）。應(yīng)用聚類分析圖分析部分差異表達(dá)的circRNA，其中hsa_circ_0005320在TNBC中上調(diào)較為顯著（圖1）。通過RTFQ-PCR檢測20對TNBC組織和癌旁組織、正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和TNBC細(xì)胞MDA-MB-231、BT-549中hsa_circ_0005320的表達(dá)，結(jié)果顯示，hsa_circ_0005320在TNBC組織和細(xì)胞中均表達(dá)上調(diào)（圖2A～B），該結(jié)果與測序結(jié)果一致，因此選擇hsa_circ_0005320進(jìn)行進(jìn)一步的研究。通過FISH實(shí)驗(yàn)檢測hsa_circ_0005320在TNBC組織和癌旁組織中的表達(dá)及定位，結(jié)果顯示，hsa_circ_0005320在TNBC中高表達(dá)，且定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2C）。

圖1 RNA-seq分析顯示TNBC組織和癌旁組織中部分差異表達(dá)的circRNA聚類圖Fig.1 Heat map of differentially expressed circRNAs in TNBC tissues and para-cancerous tissues

圖2 hsa_circ_0005320在TNBC組織和細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 The relative expression of hsa_circ_0005320 in TNBC tissues and cells

2.2 hsa_circ_0005320干擾質(zhì)粒效率驗(yàn)證

將si-NC和si-circ質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞24 h后，使用RTFQ-PCR檢測細(xì)胞中hsa_circ_0005320的相對表達(dá)水平。結(jié)果表明，與si-NC組相比，si-circ組在MDA-MB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞中hsa_circ_0005320的相對表達(dá)水平明顯降低（圖3）。

2.3 沉默hsa_circ_0005320抑制TNBC細(xì)胞的增殖

將si-NC和si-circ質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞后，通過EdU和CCK-8實(shí)驗(yàn)研究沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞增殖能力的影響。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-NC組相比，si-circ組MDA-MB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞的增殖能力明顯降低（圖4A～D）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)觀察48、72、96 h后，MDA-MB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞的si-circ組細(xì)胞活性均顯著低于si-NC組（圖4E～F）。

圖3 hsa_circ_0005320干擾質(zhì)粒效率驗(yàn)證Fig.3 Plasmid efficiency verification of hsa_circ_0005320 knockdown

2.4 沉默hsa_circ_0005320促進(jìn)TNBC細(xì)胞的凋亡

圖4 沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞增殖能力的影響Fig.4 Effects of hsa_circ_0005320 knockdown on the proliferation of TNBC cells

MDA-MB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC和si-circ質(zhì)粒后，分別采用流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst33342和Tunel實(shí)驗(yàn)檢測沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞凋亡情況的影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，MDAMB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞中si-circ組的凋亡率顯著增加（圖5A～B）。Hoechst33342實(shí)驗(yàn)表明，相比于si-NC組，si-circ組細(xì)胞的凋亡更明顯，形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞核碎裂呈致密濃染，細(xì)胞質(zhì)皺縮而發(fā)生高亮的熒光（圖5C）。Tunel實(shí)驗(yàn)顯示，si-circ組出現(xiàn)大量呈高亮熒光的凋亡細(xì)胞，而si-NC組的凋亡細(xì)胞較少（圖5D）。

2.5 沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞周期的影響

將si-NC和si-circ質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果顯示，兩個(gè)處理組細(xì)胞絕大部分在G1期，S期細(xì)胞較少，G2期細(xì)胞最少。相較于si-NC組，si-circ組在G1期的細(xì)胞增多，在S期的細(xì)胞減少（圖6A～C），表明沉默hsa_circ_0005320將細(xì)胞周期阻滯于G1期。

2.6 沉默hsa_circ_0005320調(diào)控LIF-STAT3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染si-NC和si-circ質(zhì)粒48 h后的MDA-MB-231細(xì)胞和BT-549細(xì)胞提取總蛋白，Western blot檢測LIF-STAT3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，si-circ組相較于si-NC組，LIF和P-STAT3蛋白表達(dá)水平均明顯下降（圖7）。

圖5 沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effects of hsa_circ_0005320 knockdown on apoptosis of TNBC cells

圖6 沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effects of hsa_circ_0005320 knockdown on cell cycle in TNBC

圖7 沉默hsa_circ_0005320對TNBC細(xì)胞蛋白水平的影響Fig.7 Effects of hsa_circ_0005320 knockdown on protein levels of TNBC cells

3 討 論

circRNA自首次在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)以來，一直被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接或內(nèi)含子套索過程中形成的副產(chǎn)物。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析的快速發(fā)展，大量circRNA在哺乳動物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)由典型的剪接體介導(dǎo)或上游剪接體受體跟下游剪接體供體配對形成，在具有組織和發(fā)育階段特異性特征的哺乳動物細(xì)胞中存在高度的穩(wěn)定性和序列保守性，參與調(diào)控多種生物學(xué)進(jìn)程［8-12］。circRNA可通過調(diào)控親本基因的表達(dá)［13］、選擇性剪接［14］、充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)復(fù)合物組裝的支架［15］、作為miRNAs分子的海綿［6］以及RNA-蛋白相互作用［11］來調(diào)控基因表達(dá)。因此，circRNA的研究具有非常重要的意義。本研究中的hsa_circ_0005320來源于SEPT9基因的第2外顯子，經(jīng)剪接后形成長度為645 bp的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，已有文獻(xiàn)報(bào)道其在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Ju等［16］采用RNA微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)了90個(gè)在轉(zhuǎn)移性口腔黏膜黑色素瘤中差異表達(dá)的circRNA，通過RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)檢測出hsa_circ_0005320在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中明顯上調(diào)，結(jié)合生物信息學(xué)分析證實(shí)hsa_circ_0005320可以通過與特定的microRNAs結(jié)合作為競爭的內(nèi)源性RNA，調(diào)控口腔黏膜黑色素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

然而，hsa_circ_0005320在TNBC中的研究尚未見報(bào)道。本研究采用RNA-Seq技術(shù)分析4對TNBC組織及癌旁組織，獲得差異表達(dá)的circRNA，利用RTFQ-PCR技術(shù)檢測出hsa_circ_0005320在TNBC組織和細(xì)胞中表達(dá)水平均顯著升高，進(jìn)一步通過FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa_circ_0005320在TNBC中呈高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究hsa_circ_0005320基因在TNBC中的作用，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將si-NC和si-circ質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231和BT-549細(xì)胞中，RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-circ組hsa_circ_0005320的表達(dá)水平顯著降低。通過一系列功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默hsa_circ_0005320后，能夠顯著抑制TNBC細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。最后通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa_circ_0005320可調(diào)節(jié)LIF-STAT3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，提示hsa_circ_0005320可能激活LIFSTAT3通路進(jìn)而促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果表明hsa_circ_0005320在TNBC的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用，但其具體的分子作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。