孫萌 周洪雷 張玲

摘 ?????要：建立了鬼針草總黃酮有效部位的質(zhì)量控制方法。分別采用分光光度法測定鬼針草總黃酮的含量，高效液相色譜法測定鬼針草中有效成分蘆丁和金絲桃苷的含量。鬼針草總黃酮的含量均在50%以上。蘆丁在5.12～128.0μg/mL（r=0.999 6）、金絲桃苷在4.96～124.0μg/mL（r=0.999 5）范圍內(nèi)線性良好，蘆丁平均回收率為98.76%，RSD%=1.83%;金絲桃苷回收率為97.39%，RSD%=2.41%。建立的質(zhì)量控制方法可有效控制鬼針草總黃酮有效部位的質(zhì)量。

關(guān) ?鍵 ?詞：鬼針草總黃酮; 含量; ?HPLC

中圖分類號：TQ 28 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2018）03-0467-04

Abstract： To establish the method for quality control of total flavones of Bidens pilosa L.， the content of total flavones was determined by spectrophotometric method， and HPLC was used to measure the contents of rutin and hyperoside. ?The results showed that， the content of total flavones was higher than 50%，the linear range of rutin was 5.12～128.0 μg/mL（r=0.999 6） and the average recovery was 98.76%， the linear range of hyperoside was 4.96～124.0 μg/mL（r=0.9995） and the average recovery was 97.39%. So the established method can be used for quality control of total flavones in Bidens pilosa L..

Key words：Total flavones of Bidens pilosa L.; Content; HPLC

鬼針草為菊科（Composite）鬼針草屬Bidens L.一年生植物鬼針草Bidens bipinnataL.的干燥全草。鬼針草屬植物為一年生草本，在全球約有 240 個種，資源豐富。廣泛分布在熱帶以及亞熱帶地區(qū)，在南北美洲種類最為豐富。鬼針草生長于濕地、河岸、荒地、山坡及路邊等處，易于采集使用，在我國，鬼針草有9種2變種，主產(chǎn)于東北、華北、華東、及陜西、甘肅、四川等地[1，2]。

鬼針草為中國民間常用草藥，藥用歷史悠久，其根、莖、葉或全草均可作為藥用材料。唐代陳藏器的《本草拾遺》記載：“鬼針草，味苦平，無毒”?！吨兴幋筠o典》中記載有鬼針草無毒、味苦、性平，具有清熱解毒、散瘀消腫之功效。臨床用于治療腎炎、腹瀉腸炎、痢疾、肝炎、胃痛、咽喉腫痛等，近年研究發(fā)現(xiàn)鬼針草可用于治療感冒、甲狀腺腫、慢性炎癥、糖尿病、高血壓等代謝性疾病[3，4]，以及感染性疾病和瘡癤腫痛等[5，6]

鬼針草在國外也得到很好的應(yīng)用，例如在墨西哥，花、葉用于治療胃病和糖尿病;在印度全草用于治療風(fēng)濕和炎癥;在俄國，該植屬用于治療傷風(fēng)感冒、咽喉腫痛等） [7-10]。

鬼針草的化學(xué)成分比較復(fù)雜，成分比較明確。其主要成分為黃酮（包括橙酮、黃酮、查耳酮、黃酮醇、二氫黃酮等）、烯炔類（目前主要有19種化合物）、揮發(fā)油（主要含有脂肪烷和脂肪酸類，還含有少量的醛、酮烯等）、氨基酸（含有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、賴氨酸等17種氨基酸，其中8種為人體必需氨基酸）及微量元素以及生物堿、蒽醌苷、糖、胡蘿卜素、維生素等[11-13]。

本文采用紫外分光光度法測定藥用部位總黃酮的含量，采用高效液相色譜法測定鬼針草藥用部位中蘆丁和金絲桃苷的含量，并建立了相應(yīng)的方法學(xué)。以此作為控制鬼針草總黃酮的指標(biāo)之一，為開發(fā)利用鬼針草資源提供相關(guān)參考。

1 ?實(shí)驗儀器與試藥

Agilient1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫）;紫外可見分光光度計（UV-3600Plus，島津中國）;真空干燥箱（南京天利制藥設(shè)備有限公司）;鬼針草藥總黃酮（自制）。蘆?。ü┖繙y定用，批號100080-200707）、金絲桃苷（供含量測定用，批號111521-201004）對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，HPLC實(shí)驗所用試劑均為色譜純，實(shí)驗用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純（AR）。

2 ?實(shí)驗方法與結(jié)果

2.1 ?總黃酮的測定

2.1.1 ?供試品溶液的制備

精密稱取鬼針草總黃酮50 mg，置于50 mL容量瓶中， 加入乙醇適量，超聲溶解， 放冷后， 加乙醇至容量瓶刻度，充分搖勻，密閉保存，備用。

2.1.2 ?對照品溶液的制備

取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品，精密稱定10.8 mg， 置50 mL容量瓶中，加適量乙醇溶解后，再加入乙醇至刻度，搖勻，得到濃度為0.216 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

2.1.3 ?線性關(guān)系

取2.1.2制備的蘆丁對照品溶液，精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL的容量瓶之中， 各容量瓶再分別加入蒸餾水至6 mL，5 %亞硝酸鈉1 mL，搖勻， 放置6 min 后，10 %硝酸鋁1 mL， 充分搖勻后放置6 min;加入NaOH試液10 mL后加蒸餾水直至刻度，充分搖勻，放置15 min，以上述相應(yīng)試劑作為空白對照溶液，于UV-3600Plus紫外可見分光光度計，在190～760 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，得樣品的最大吸收波長為510 nm ， 故選擇510 nm為檢測波長。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)， 濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制測定標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計算回歸方程為：Y=11.436X-0.0158（r=0.999 5）。結(jié)果表明， 蘆丁檢測濃度在8.64～51.84 ?g·mL-1 范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 ?精密度試驗

取2.1.1制備的供試品溶液，按照上述測定條件測定供試品吸收度，重復(fù)測定6 次，計算，結(jié)果表明結(jié)果RSD為0.88 %，顯示儀器精密度良好。

2.1.5 ?穩(wěn)定性試驗

取2.1.1制備的供試品溶液，室溫放置，每隔一段時間測定供試品吸光度，計算，結(jié)果RSD為0.96 %，表明供試品溶液在30 min 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 ?重現(xiàn)性試驗

精密稱取同一批鬼針草總黃酮樣品6 份，分別按2.1.1方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算樣品RSD為1.26%，表明該測定方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.1.7 ?加樣回收率試驗

取已知含量的鬼針草總黃酮樣品，精密稱量6份，每份25 mg，分別精密加入蘆丁對照品適量，按照2.1.1方法制備供試品溶液，進(jìn)行吸光度測定，根據(jù)2.1.3項下回歸方程計算，結(jié)果表明平均回收率為99.12%， RSD為1.98%。

2.1.8 ?樣品含量測定

精密稱取5 批鬼針草黃酮樣品各50 mg，分別按上述方法制備供試品溶液并測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮含量，結(jié)果表明5 批鬼針草總黃酮含量分別為50.22%、53.15%、51.98%、52.36%、52.58%。

2.2HPLC含量的測定

2.2.1 ?色譜條件

Welch materials C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;乙腈-0.2%冰醋酸梯度洗脫，洗脫程序為0～5 min，5%乙腈;5～15 min，5%→15%乙腈;15～25 min，15%→25%乙腈;25～35 min，25%→30%乙腈;35～45 min，30%→60%乙腈;45～60 min，60%→5%乙腈;流速：1 mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：360 nm;進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖 1、圖2。

2.2.2 ?對照品溶液制備

分別精密稱定蘆丁和金絲桃苷對照品適量，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，制備成25.6 μg/mL的蘆丁對照品液和24.8 μg/mL的金絲桃苷對照品液。

2.2.3 ?供試品溶液制備

精密稱取總黃酮約20 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2.4 ?線性關(guān)系

精密吸取0，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL系列對照品溶液于10 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋定容，按色譜條件測定，以峰面積A對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作圖，得蘆丁回歸方程：Y=1216.56X+458.76（r=0.9996），金絲桃苷回歸方程：Y=979.88X-127.37（r=0.999 5）。蘆丁在5.12～128.0μg/mL、金絲桃苷在4.96～124.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 ?精密度試驗

精密吸取蘆丁對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測定蘆丁色譜峰峰面積，計算表明蘆丁的RSD分別為1.81%。同樣方法計算金絲桃苷的RSD為1.91%。表明該儀器具有良好精密度。

2.2.6 ?穩(wěn)定性試驗

精密吸取蘆丁和金絲桃苷對照品溶液分別于0、1、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定吸收峰面積，結(jié)果表明蘆丁和金絲桃苷的RSD分別為2.05%和1.98%，表明蘆丁和金絲桃苷對照品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 ?重復(fù)性試驗

取同一批鬼針草總黃酮樣品，精密稱取6份，分別按照2.2.3方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算蘆丁色譜峰的峰面積，RSD為2.37%。同樣方法計算金絲桃苷的RSD為2.42%。

2.2.8 ?回收率試驗

取已知含量的鬼針草總黃酮樣品，精密稱定約10 mg，共取6份，精密加入蘆丁對照品適量，制備樣品、測定后計算含量，平均回收率為98.76%，RSD為1.83%。 同樣方法測定金絲桃苷平均回收率為97.39%，RSD為2.41%。

2.2.9 ?樣品測定

取5批鬼針草總黃酮樣品，同2.2.3制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖，按峰面積用外標(biāo)法計算含量，結(jié)果表明總黃酮中蘆丁的含量為5.95%，金絲桃苷的含量為4.21%。

3 ?結(jié) 論

3.1 ?樣品處理

本實(shí)驗測定鬼針草總黃酮的含量時，由于鬼針草中葉綠素含量較多，導(dǎo)致提取液顏色較深，通過查閱文獻(xiàn)，何微[14]等在進(jìn)行用分光光度法測定枸杞葉中總黃酮的實(shí)驗中，比較了經(jīng)過石油醚脫色后的總黃酮與不脫色的枸杞葉總黃酮的含量的含量基本一致，樣品提取過程中可不用脫色處理。前期我們在制備鬼針草總黃酮時，分別對鬼針草藥材進(jìn)行了石油醚脫色和不脫色，結(jié)果表明脫色和不脫色對于鬼針草總黃酮的影響不大。在測定鬼針草總黃酮含量時，石油醚脫色與否幾乎不影響測定，故在測定時不用提前脫色。

3.2 ?實(shí)驗結(jié)果分析

本文采用紫外分光光度法測定了鬼針草總黃酮的含量，并對其進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明紫外分光光度法測定總黃酮，方法簡便、測定快速、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，可用于鬼針草總黃酮的含量測定。

本文建立了HPLC方法測定鬼針草總黃酮中蘆丁和金絲桃苷含量的方法。該方法可對鬼針草總黃酮進(jìn)行分離分析，在有對照品的前提下，能夠準(zhǔn)確進(jìn)行各種成分的定量分析，準(zhǔn)確度和靈敏度高[15]，可為鬼針草藥材和總黃酮提取物質(zhì)量控制的建立提供研究依據(jù)。

3.3 ?鬼針草黃酮前景

鬼針草是我國傳統(tǒng)民間中草藥，含有多種化學(xué)成分，其中藥物的主要成分黃酮，具有多種生理活性和臨床藥效。藥理藥效實(shí)驗證明，鬼針草的總黃酮具多種藥用活性[16-18]。因此，從鬼針草藥材中分離制備總黃酮并建立總黃酮的質(zhì)量控制方法，為確定鬼針草的活性部位和活性成分，深入研究藥效物質(zhì)的作用機(jī)制，以及進(jìn)一步合理開發(fā)和利用鬼針草提供了科學(xué)依據(jù)和重要支撐。

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