楊溢鐸 李 佶

圍絕經(jīng)期是女性自生育期的規(guī)律月經(jīng)過渡到絕經(jīng)即永久性無(wú)月經(jīng)狀態(tài)的階段，包括從出現(xiàn)與卵巢功能下降有關(guān)的內(nèi)分泌、生物學(xué)和臨床特征起至末次月經(jīng)后一年。建立圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型，模仿人類自然圍絕經(jīng)期的卵巢功能變化，可以幫助研究圍絕經(jīng)期遠(yuǎn)期疾病和卵巢儲(chǔ)備功能下降的發(fā)病機(jī)制。本文回顧分析了近年來(lái)常用的制備圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型的方法，通過比較各類模型的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)，以期尋找出制備圍絕經(jīng)期的理想動(dòng)物模型。

一、去勢(shì)模型

最早的圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型主要是去勢(shì)模型，即手術(shù)完全或部分摘除大鼠或小鼠的兩側(cè)卵巢。臧凱等[1]選取3月齡雌性未孕SD大鼠，完全切除或部分切除大鼠的卵巢，術(shù)后21只各組大鼠腹主動(dòng)脈采血的結(jié)果均示血清雌二醇(E2)水平顯著降低，卵泡刺激素(FSH)水平顯著升高，子宮組織形態(tài)學(xué)顯示各去勢(shì)組大鼠子宮內(nèi)膜上皮呈不同程度的萎縮變薄，間質(zhì)、腺體稀疏，血管減少，結(jié)論證明采取手術(shù)去勢(shì)方法制備圍絕經(jīng)期大鼠模型具有可行性。

去勢(shì)模型分完全去勢(shì)和部分去勢(shì)，完全去勢(shì)即摘除雙側(cè)卵巢較摘除部分卵巢操作簡(jiǎn)單，并且適用范圍更廣。因?yàn)槁殉惭┴S富，摘除一側(cè)的部分卵巢不易止血，并且摘除部分的多少不能定量，往往憑借操作者的主觀感受。雖然摘除部分卵巢更符合女性圍絕經(jīng)期存在卵巢這一事實(shí)，但是手術(shù)操作影響卵巢的血供，殘存卵巢的功能無(wú)法評(píng)估，模型之間差異大，無(wú)法做到標(biāo)準(zhǔn)化。更重要的是卵巢切除后，除雌激素、孕激素水平下降外，一些卵巢分泌的其他激素如雄激素也會(huì)降低，這些激素可能在圍絕經(jīng)期中起重要的作用，并對(duì)下丘腦和垂體分泌的激素有反饋?zhàn)饔肹2]。摘除卵巢后，雌激素、促黃體生成素、卵泡刺激素和促性腺激素釋放激素(GnRH)的中樞調(diào)節(jié)器也將隨之被耗竭，而這些激素均對(duì)大腦有激活作用[3]。同時(shí)還存在其他問題需要解決，如大鼠去勢(shì)手術(shù)的最佳年齡，因?yàn)榍嗄晔蠛屠夏晔髮?duì)雙側(cè)卵巢切除有不同的反應(yīng)。與年長(zhǎng)動(dòng)物比較，青年鼠的血清雌激素水平下降地更快。此外，對(duì)于部分去勢(shì)手術(shù)中另一側(cè)卵巢的保留體積，目前仍沒有定論，需要去進(jìn)一步探索。

總體來(lái)說，去勢(shì)模型成功率高，操作簡(jiǎn)便，使用廣泛，結(jié)局可靠，手術(shù)完成后雌激素的水平迅速下降，絕經(jīng)中雌激素降低的診斷標(biāo)準(zhǔn)更容易達(dá)到[4]。但是自然的圍絕經(jīng)期激素水平波動(dòng)幅度很大，并且是在正常水平上下的波動(dòng)，激素水平并非立即降低。所以去勢(shì)模型更適合用于絕經(jīng)后期相關(guān)疾病的研究及人工絕經(jīng)后的病理研究。同時(shí)，兩種去勢(shì)模型對(duì)于圍絕經(jīng)期常見的烘熱汗出、憂郁健忘、心悸失眠等臨床癥狀都沒能很好體現(xiàn)。

二、藥物損傷卵巢模型

藥物損傷卵巢模型一般采用抗腫瘤藥物，免疫抑制劑等有生殖毒性的藥物通過腹腔注射或灌胃的方式連續(xù)給藥一段時(shí)間后，造成卵巢功能的下降，從而制備圍絕經(jīng)期的動(dòng)物模型。張娟等[5]選取家兔予環(huán)磷酰胺連續(xù)注射一段時(shí)間后，卵巢切片HE染色發(fā)現(xiàn)，使用環(huán)磷酰胺后原始卵泡和初級(jí)卵泡的異常率升高，卵泡中的顆粒細(xì)胞凋亡率增高，且雌激素的水平呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。并得出結(jié)論以 50mg/kg 劑量連續(xù)注射2天是建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)家兔卵巢早衰模型的最佳造模方式。

近些年，人們又逐漸發(fā)現(xiàn)了雷公藤的生殖毒性，長(zhǎng)時(shí)間服用的女性出現(xiàn)卵巢功能下降甚至衰竭，具體表現(xiàn)為雌激素的分泌降低，導(dǎo)致FSH和LH的升高，女性出現(xiàn)月經(jīng)量少甚至閉經(jīng)[6]。受此啟發(fā)，有研究者提出采用雷公藤多苷片制備圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型。何國(guó)珍等[7]選擇SD大鼠，予雷公藤多苷片溶液40 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃10周后發(fā)現(xiàn)，雷公藤大鼠模型組的生長(zhǎng)卵泡和黃體數(shù)減少，血清中雌激素和孕酮水平降低，卵巢指數(shù)降低，但卵泡刺激素的水平無(wú)明顯變化，認(rèn)為雷公藤多苷片可以導(dǎo)致雌性大鼠的卵巢功能降低，用于建立卵巢功能低下的模型可行。目前，采用雷公藤多苷片建立卵巢功能衰退的模型在國(guó)內(nèi)外都非常經(jīng)典，造模簡(jiǎn)單可行，但用藥時(shí)間的長(zhǎng)短和使用劑量說法不一，不易把握，對(duì)于用藥后多長(zhǎng)時(shí)間能達(dá)到圍絕經(jīng)期及卵巢早衰的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚無(wú)統(tǒng)一意見。如何標(biāo)準(zhǔn)化雷公藤多苷片造模使用的劑量和時(shí)間及各時(shí)間節(jié)點(diǎn)卵巢及內(nèi)分泌出現(xiàn)的相應(yīng)變化是下一步亟待解決的問題。

藥物損傷卵巢的造模方法簡(jiǎn)單，并且卵巢切片示各級(jí)卵泡不同程度地減少，動(dòng)情周期表現(xiàn)為不同形式的紊亂，與圍絕經(jīng)期的卵巢組織學(xué)和內(nèi)分泌表現(xiàn)類似，但這些實(shí)驗(yàn)研究均未長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠的激素水平和動(dòng)情周情的變化，所以停止用藥后是否大鼠持續(xù)卵巢功能衰退的狀態(tài)以及持續(xù)的時(shí)間，卵巢開始恢復(fù)排卵的時(shí)間不得而知。

三、射線損傷卵巢的動(dòng)物模型

1.X線照射破壞卵巢動(dòng)物模型：卵巢是女性生殖系統(tǒng)中對(duì)放射治療最敏感的器官，所以經(jīng)過X線放射治療后卵巢較全身其他器官損傷更為嚴(yán)重。X線主要作用于細(xì)胞核，可引起DNA雙鏈或單鏈的斷裂，從而抑制DNA的合成和復(fù)制，阻止細(xì)胞的有絲分裂。X線對(duì)細(xì)胞有絲分裂的不同階段都有殺傷作用，但處于有絲分裂 G2期和M期的細(xì)胞對(duì)放射尤其敏感。而卵巢中的生殖細(xì)胞恰巧多處于第一次減數(shù)分裂前期和第二次減數(shù)分裂中期，相當(dāng)于有絲分裂的M期[8]。所以X線照射會(huì)直接影響卵巢生殖細(xì)胞的有絲分裂，從而破壞卵巢功能。同時(shí)X線也會(huì)增加卵巢內(nèi)氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。

賀宇恒等[10]采用放射治療的方式加速卵巢功能衰竭，選取8周齡C57BL6雌性小鼠，單次全身照射一定劑量的X線，7天后發(fā)現(xiàn)小鼠的雙側(cè)卵巢濕重下降，并且血清卵泡刺激素的水平顯著升高，卵巢切片原始卵泡和生長(zhǎng)卵泡計(jì)數(shù)均顯著下降。追蹤監(jiān)測(cè)放療后14天、21天、28天和42天的相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠的卵巢濕重逐漸下降，血清FSH水平逐漸升高，血清 E2水平則逐漸降低；卵巢內(nèi)原始卵泡數(shù)和生長(zhǎng)卵泡數(shù)逐漸減少至完全耗盡，至42天時(shí)卵巢內(nèi)僅見閉鎖卵泡。

2.鈷60γ射線破壞卵巢動(dòng)物模型：孫萍等[11]對(duì)于造模大鼠予鈷60γ射線照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈷60γ射線會(huì)加快大鼠卵巢功能衰退的進(jìn)程，能直接阻礙卵泡的正常發(fā)育，損傷大鼠的生殖功能。此種方法造?？煽浚页晒β时容^高。但如同X線照射，對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求較高，一般實(shí)驗(yàn)室人員不易掌握劑量及暴露時(shí)間，且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的健康有潛在的威脅，臨床主要用于研究惡性腫瘤放射治療對(duì)組織器官的影響。

射線損傷卵巢的造模方法操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成功率高且動(dòng)物病死率低，為圍絕經(jīng)期疾病的基礎(chǔ)研究提供了穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型來(lái)源，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和條件要求高，并且X線照射的時(shí)間及劑量需要摸索不易掌握，同時(shí)X線照射對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有一定的傷害，所以限制了此方法在臨床上的應(yīng)用。

四、加速卵巢衰竭模型

目前，國(guó)內(nèi)外常用VCD作為加速卵巢衰竭模型(AOF模型)制備的造模藥[12]。AOF模型包括了圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后模型，筆者主要研究的是圍絕經(jīng)期的動(dòng)物模型[13]。VCD為4-乙烯基環(huán)己烯(VCH)的代謝物(VCD)，VCH是輪胎生產(chǎn)硫化過程中產(chǎn)生的1,3-丁二烯的二聚體。VCD目前常被用作雙環(huán)氧化合物和環(huán)氧樹脂的有效中間體和反應(yīng)稀釋劑。化工原料4-乙烯基環(huán)工烯(VCD)可選擇性作用于動(dòng)物原始及初級(jí)卵泡，能加速卵母細(xì)胞的閉鎖率，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞的凋亡[14]。Dinh等[15]聯(lián)合使用VCD 和鄰苯二甲酸鹽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組血清AMH水平明顯降低。此外，聯(lián)合用藥組血清促卵泡激素水平顯著升高。

VCD制備的圍絕經(jīng)期模型更接近于人類的圍絕經(jīng)期。此模型維持了卵巢組織的存在，這點(diǎn)符合人類圍絕經(jīng)期存在卵巢這一事實(shí)。同時(shí)VCD模型大鼠的內(nèi)分泌變化也符合人類的圍絕經(jīng)期表現(xiàn)。因?yàn)閂CD是逐漸耗竭了小鼠或大鼠的原始卵泡和初級(jí)卵泡，而對(duì)次級(jí)卵泡和竇卵泡無(wú)影響，由于可供募集的卵泡減少，最終導(dǎo)致血清 E2水平下降，LH和FSH水平的升高，與生理性卵巢功能衰退的表現(xiàn)類似。體現(xiàn)出了卵巢功能逐漸下降的過程，能夠反應(yīng)出圍絕經(jīng)期動(dòng)情周期的不規(guī)則性和波動(dòng)性，尤其是雌激素水平的波動(dòng)性，成功復(fù)制了人類的圍絕經(jīng)期，是目前制備圍絕經(jīng)期大鼠的理想模型。同時(shí)，VCD在低劑量給藥時(shí)，在引起原始卵泡凋亡的同時(shí)不影響其他周圍組織，如肝臟和脾臟，也不穿過血-腦脊液屏障，安全性較高。目前國(guó)外已將AOF模型用于實(shí)驗(yàn)研究更年期心血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、腫瘤等。

五、自然衰老動(dòng)物模型

在人類的絕經(jīng)期，雌激素水平非常低或不可檢測(cè)，孕酮水平下降，促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)水平升高。自然狀態(tài)下中年大鼠從9～12個(gè)月齡開始表現(xiàn)出不規(guī)則的動(dòng)情周期，通常以動(dòng)情周期的延長(zhǎng)為特征，將此階段定義為圍絕經(jīng)期，此階段的大鼠可作為圍絕經(jīng)期模型，用于圍絕經(jīng)期的病因、機(jī)制及治療的相關(guān)研究。自然衰老的模型與人類圍絕經(jīng)期生物學(xué)特征相似，子宮、卵巢、胸腺等器官的重量和形態(tài)上的改變以及性激素、神經(jīng)遞質(zhì)、自由基等的改變與人類圍絕經(jīng)期的擬合度較高，而且能避免去卵巢或射線照射等原因造成的動(dòng)物意外死亡，是研究圍絕經(jīng)期的典型動(dòng)物模型，使用比較廣泛，但造模周期長(zhǎng)，費(fèi)用較高，時(shí)間和人力成本高，因此限制了此類模型的應(yīng)用。

六、免疫模型

免疫模型主要利用免疫反應(yīng)破壞動(dòng)物卵巢組織。王佩娟等[16]將A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠進(jìn)行雜交繁殖B6AF1小鼠，篩選出B6AF1雌性小鼠，然后利用透明帶ZP3多肽免疫B6AF1雌性小鼠14天，發(fā)現(xiàn)小鼠動(dòng)情周期紊亂，卵巢組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，卵巢中有明顯透明帶出現(xiàn)，血清中性激素E2含量下降，并且FSH含量上升，利用透明帶多肽ZP3免疫B6AF1雌性小鼠能夠成功建立自身免疫性卵巢早衰模型，該模型發(fā)生率高，方法簡(jiǎn)單，但臨床上主要用于免疫性因素導(dǎo)致的卵巢早衰的研究，應(yīng)用于圍絕經(jīng)期卵巢功能下降的研究則較少見。

七、制動(dòng)應(yīng)激致大鼠卵巢功能衰退

申可佳等[17]采用慢性制動(dòng)應(yīng)激的方法建立卵巢早衰及卵巢低反應(yīng)小鼠模型，自制制動(dòng)器限制小鼠的活動(dòng)，連續(xù)14天將小鼠放入制動(dòng)器內(nèi)制動(dòng)，制動(dòng)時(shí)間從3h開始，逐漸延長(zhǎng)至每天6h，造成小鼠慢性應(yīng)激狀態(tài)，制動(dòng)期間發(fā)現(xiàn)小鼠的進(jìn)食、毛色等一般情況變差，體重明顯減輕(P<0.05)，動(dòng)情周期異常的例數(shù)明顯增多(P<0.05)，結(jié)果提示慢性制動(dòng)應(yīng)激可以引起小鼠卵巢功能紊亂或減退。該模型相比去勢(shì)模型，操作較繁瑣，制備時(shí)間長(zhǎng)，成功率不高，且有悖倫理，因此限制了該模型的臨床應(yīng)用。

目前，用于制備圍絕經(jīng)期綜合征動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物除了大(小)鼠，還有雌性綿羊、兔、狗及靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。但筆者常采用的是雌性大鼠、小鼠制備圍絕經(jīng)期模型。因?yàn)殪`長(zhǎng)類動(dòng)物成本高、難得到，限制了其應(yīng)用。綿羊、狗因?yàn)轶w積大或價(jià)格較高而應(yīng)用受限，家兔手術(shù)時(shí)死亡較多，操作不易。但是，如果不考慮成本等因素，我們應(yīng)該去尋求和使用靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為更好的模型，因?yàn)殪`長(zhǎng)類動(dòng)物與人的生理過程更相似。

苗明三等[18]將圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型分為病因模型，病理模型和病證結(jié)合模型，病因模型即本文所述的自然衰老模型，病理模型即去勢(shì)法制備的模型，包括完全去勢(shì)法和部分去勢(shì)法。對(duì)于病理模型，該研究?jī)H提到了去勢(shì)法和乙醇損傷卵巢的方法，結(jié)合本文的分析，還應(yīng)包抗腫瘤藥物損傷卵巢，及VCD等其他藥物損傷卵巢的方法。文中的病證結(jié)合模型主要用于中醫(yī)藥治療圍絕藥期綜合征的研究，模型制備基于的是中醫(yī)的理論基礎(chǔ)，應(yīng)用范圍受到一定限制。

對(duì)于圍絕經(jīng)期動(dòng)物模型的制備，筆者認(rèn)為關(guān)鍵的難點(diǎn)不在于制備方法，制備方法的選擇有多種，難點(diǎn)在于判定的療效指標(biāo)，因?yàn)閲^經(jīng)期女性的卵巢功能并非完全喪失，血清激素的水平波動(dòng)很大，動(dòng)物之間的個(gè)體差異也很大。苗明三等對(duì)模型的判斷指標(biāo)包括生化指標(biāo)、表觀指標(biāo)和病理學(xué)指標(biāo)。其中生化指標(biāo)是最重要的指標(biāo)，核心指標(biāo)為雌二醇(E2)和血清卵泡生成激素(FSH)、LH、T等，生化指標(biāo)權(quán)重系數(shù)為0.4。表觀的核心指標(biāo)為毛發(fā)光澤度、毛發(fā)脫落情況，精神狀態(tài)和飲食量，權(quán)重系數(shù)為0.3。病理學(xué)指標(biāo)中最重要的是卵巢和子宮，權(quán)重系數(shù)也為0.3，最終計(jì)算出的總積分>0.6，則可認(rèn)為該模型制備成功。筆者認(rèn)為這3種指標(biāo)中的表觀指標(biāo)有待商榷，因?yàn)楸碛^指標(biāo)的判定沒有量化標(biāo)準(zhǔn)，受人為主觀因素影響非常大，苗明三起草的表觀指標(biāo)中尤其是毛發(fā)脫落情況和精神狀態(tài)的判斷，不容易標(biāo)準(zhǔn)化[22]。筆者認(rèn)為對(duì)于模型造模成功的最主要判斷方法應(yīng)該是生化指標(biāo)和卵巢的病理指標(biāo)。生化指標(biāo)中最重要的是E2和FSH的波動(dòng)水平，并且不能是單一的一次采血結(jié)果，應(yīng)該至少連續(xù)3次在同一動(dòng)情周期采血。目前，造模后取材和采血的時(shí)間點(diǎn)的確定是個(gè)很大的難點(diǎn)。因?yàn)閷?duì)于嚙齒類動(dòng)物來(lái)說，不同的時(shí)間點(diǎn)動(dòng)情周期不一致，在不同的動(dòng)情周期中，生化指標(biāo)和卵巢切片的結(jié)果不一定一致，所以應(yīng)該根據(jù)每只大鼠的動(dòng)情周期確定采血時(shí)間，反復(fù)采血監(jiān)測(cè)生化指標(biāo)的波動(dòng)情況，但連續(xù)采血對(duì)動(dòng)物本身傷害大，常用的眼眶采血對(duì)操作者的技術(shù)水平要求高，容易造成大鼠失明，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)有一定的干擾?？傊?，反復(fù)采血的間隔時(shí)間及造模后怎樣規(guī)定采血時(shí)間仍需要我們進(jìn)一步探索，畢竟，圍絕經(jīng)期的激素水平并非是直接跌入谷底，而是在正常值的基礎(chǔ)上出現(xiàn)較大幅度的波動(dòng)，直到真正絕經(jīng)后才維持在持續(xù)的低水平。而對(duì)于病理指標(biāo)，應(yīng)以卵巢為主，因?yàn)閲^經(jīng)期的本質(zhì)就是卵巢功能的逐漸衰退，子宮內(nèi)膜的變化是受卵巢分泌激素的影響。同時(shí)，造模的參考標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)該是去勢(shì)模型，而是自然衰老的動(dòng)物模型，因?yàn)槿?shì)模型與自然的圍絕經(jīng)期存在卵巢這一事實(shí)完全不符。所以，應(yīng)先探索出自然衰老模型的動(dòng)情周期變化，總結(jié)出規(guī)律后，再去判斷其他模型是否成功。

綜上所述，目前比較理想的制備圍絕經(jīng)期大鼠的模型是VCD制備的模型和雷公藤損傷卵巢的模型，它們操作簡(jiǎn)便，給藥方便，耗時(shí)短，花費(fèi)相對(duì)較低，并且模型原理與人類圍絕經(jīng)期的生理變化類似，擬合度更高。實(shí)驗(yàn)人員在具體的研究中應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和目的選擇合適的動(dòng)物模型。同時(shí)期望日后有更符合人類圍絕經(jīng)期自然生理過程且操作方便的動(dòng)物模型，也希望有更多大樣本圍絕經(jīng)期模型的療效指標(biāo)數(shù)據(jù)，以便于造模后的療效判定指標(biāo)也能夠標(biāo)準(zhǔn)化，從而為女性圍絕經(jīng)期及卵巢功能下降的研究奠定更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。