陳 森 李養(yǎng)群 楊 喆 王維新 馬 寧 劉啟宇

唇腭裂(cleft lip and palate, CLP)是一種常見的先天性畸形，在不同地區(qū)和不同人種間發(fā)生率有一定差異性，大約為0.03%～0.24%[1]。唇腭裂包括唇裂伴或不伴腭裂(cleft lip with or without cleft palate, CL/P) 以及單純腭裂(cleft palate only, CPO)，也可以依據(jù)是否伴有其他畸形，分為可劃分為綜合征型唇腭裂(syndromic cleft lip with or without cleft palate, SCL/P)及非綜合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)，其中NSCL/P占70%左右。NSCL/P的致病因素的研究已經(jīng)有多年的歷史，目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，其發(fā)病是環(huán)境因素和基因因素相互作用的結(jié)果。本文旨在回顧和NSCL/P發(fā)病因素有關(guān)的重要研究，并且總結(jié)最新的研究進(jìn)展。

一、環(huán)境因素

母親在孕期主動(dòng)吸煙是已經(jīng)確認(rèn)的高危因素之一。目前研究估計(jì)，如果進(jìn)行徹底的戒煙，那么大概會(huì)有6.1%的唇腭裂是可以避免的[2]。被動(dòng)吸煙(二手煙)也同樣是高危因素之一，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(transforming growth factor- α，TGFα)與吸煙的交互作用對(duì)于NSCL/P的發(fā)生有影響[3,4]。除了TGF-α以外其他的許多基因也被認(rèn)為和吸煙有交互作用，但是尚未達(dá)成一致意見，例如TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)等[5，6]。

盡管對(duì)于孕期飲酒是否會(huì)促進(jìn)唇腭裂的發(fā)病尚未達(dá)成統(tǒng)一意見，但是在短期內(nèi)大量攝入酒精會(huì)使患病風(fēng)險(xiǎn)升高[7]。但具體機(jī)制也不明確。這可能與Msx1(MSH Homeobox 1，Msx1)基因也存在一定的交互[8]。但是研究者尚未達(dá)成一致。

環(huán)境因素除了直接作用于孕婦和患兒，也同樣和基因共同影響胎兒發(fā)育。盡管部分觀點(diǎn)尚未獲得廣泛的認(rèn)可，大量研究者依舊認(rèn)為吸煙、飲酒、維生素?cái)z入都是與基因易感性密切相關(guān)。從目前的研究看來，基因和環(huán)境之間的相互作用非常重要，但是獲得具有意義和可重復(fù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)卻非常困難[9]。

二、唇腭裂的家族聚集性和致病基因

唇腭裂表現(xiàn)了明顯的家族聚集性，表明其具有特定的致病基因。從18世紀(jì)開始，就有研究者關(guān)注唇腭裂的遺傳性，但是迄今為止仍然沒有發(fā)現(xiàn)確切的發(fā)病基因。一般而言，患者近親的發(fā)生概率明顯升高。Grosen等[10]調(diào)查了1952～2005年間6776例患兒和54229名親屬，最終認(rèn)為CL/P患者第1代親屬患病率最高，但是到了第2代親屬(兄弟，叔伯、祖父母)明顯下降，而到了第3代親屬則與普通人群相似。

盡管唇腭裂的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有明確的家族聚集性，但是卻沒有符合孟德爾的遺傳規(guī)律。從20世紀(jì)初開始，逐漸有研究者利用分離分析(segregation analysis)探索NSCL/P家族基因遺傳規(guī)律。到了20世紀(jì)70年代混合模型(mixed model)被提出，混合模型的優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)考慮到傳統(tǒng)孟德爾遺傳規(guī)律中的主要基因和具有遺傳性的非獨(dú)立基因。但是這一方法很難獲得一個(gè)具有可重復(fù)性的確切結(jié)果。大量的研究還是表明在遺傳方面最適合的研究模型是多因素閾值模型(multifactorial threshold model, MF/T)。但是，MF/T無法推測(cè)外顯率，并且通過其他模型也可以獲得相似的結(jié)果。所以，目前仍然沒有得到一個(gè)適用于所有家庭的方法。這也從一個(gè)側(cè)面表明，多個(gè)基因可能共同影響了唇腭裂患者的發(fā)病。

三、唇腭裂的基因定位

基因?qū)W的發(fā)展為探索非典型的遺傳規(guī)律提供了更多機(jī)會(huì)。連鎖分析(linkage analysis)和相關(guān)分析(association analysis)是最常用的工具。這兩者都可以用于發(fā)現(xiàn)特定的遺傳標(biāo)記、特定基因和探知突變基因，是從基因組層面探索唇腭裂發(fā)病的良好工具，多種基因被發(fā)現(xiàn)，染色體1q32附近的干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子6(interferon regulatory transcription factor 6，IRF6)是最重要的發(fā)現(xiàn)。

相比與連鎖分析方法，相關(guān)分析的統(tǒng)計(jì)原理更加簡(jiǎn)單，獲得的數(shù)據(jù)更有普遍意義。在過去的25～30年里，許多研究者利用相關(guān)分析，采用病例對(duì)照或者核心家系(患者和父母)的研究方法，檢測(cè)了大量候選基因，但是結(jié)果并不是總能保持一致。原因可能是樣本量不足，設(shè)計(jì)偏倚和基因多樣性等。通過對(duì)候選基因的測(cè)序發(fā)現(xiàn)，一些罕見的基因突變可能會(huì)修復(fù)協(xié)同基因的功能，這也可能是研究結(jié)果不一致的原因之一[11]。Leslie等[12]利用這種方法結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)、核心家系方法研究檢測(cè)了13個(gè)目標(biāo)基因，其中2個(gè)基因(NOG、NTN1)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而4個(gè)基因(BMP4、FGFR2、MSX1、PTCH1)無意義，但是這結(jié)果具有爭(zhēng)議，和許多研究者的研究結(jié)果相互矛盾，需要深入研究。

進(jìn)入21世紀(jì)后，大樣本單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和GWAS逐漸普及，并廣泛應(yīng)用于唇腭裂的基因研究，大量的基因被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，其中最重要的是IRF6、MAFB、VAX1、WNT信號(hào)通路、Msx1和BMP信號(hào)通路。

1.IRF6： IRF6與NSCL/P發(fā)病有關(guān)的結(jié)果得到了GWAS研究結(jié)果的驗(yàn)證，但是由于人群基因的特異性，部分結(jié)果難以復(fù)制[13]。IRF6也被證明是P63的作用靶點(diǎn)之一，目前也發(fā)現(xiàn)P63可以導(dǎo)致多種以CLP為臨床表現(xiàn)的綜合征，P63通過增強(qiáng)子的作用促進(jìn)IRF6的轉(zhuǎn)錄，這個(gè)過程中的任何變異都會(huì)促使CL/P的發(fā)生[14,15]。

2.MAFB：肌腱膜纖維肉瘤癌基因B型同系物基因(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B,MAFB)基因編碼堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子。在一個(gè)亞洲的研究中，MAFB基因和NCL/P發(fā)病呈現(xiàn)強(qiáng)烈的相關(guān)性，在獨(dú)立重復(fù)樣本中，這一結(jié)果也被驗(yàn)證有效(歐洲人，P=0.0007；亞洲人，P=0.0009)。在菲律賓人中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)和CL/P有關(guān)的錯(cuò)義突變(H131Q)位于保守序列中，這提示一些MAFB兩側(cè)基因區(qū)中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)也可能會(huì)影響CL/P發(fā)病[16]。

3.VAX1：在Beaty等[16]的研究中，CL/P患者都在10q25染色體附近發(fā)現(xiàn)了腹前同源盒(ventral anterior homeobox 1，VAX1)基因的2個(gè)SNPs(rs7078160和s4752028)高表達(dá)。VAX1編碼DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄同源盒的調(diào)節(jié)因子。同時(shí)，在如歐洲、中非、東南亞等人種中的研究也表明了VAX1多態(tài)性與NSCL/P的關(guān)聯(lián)[17]。

4.WNT信號(hào)通路：盡管WNT(wingless -type MMTV integration site family)信號(hào)通路和NSCL/P之間的關(guān)系尚未被GWAS驗(yàn)證，但是研究表明WNT信號(hào)通路相關(guān)的基因突變與NSCL/P密切相關(guān)，Wnt9b基因被認(rèn)為是NSCL/P的高?；颍诖讲堪l(fā)育形成過程中扮演重要角色[18]。

但是這些結(jié)果在不同人種之間差異很大，這是因?yàn)榧夹g(shù)本身的局限性，也可能是由于GWAS會(huì)忽略部分在發(fā)育過程中起到了重要調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)基因[19]。

四、后GWAS時(shí)代

GWAS后，一些新的技術(shù)逐漸成熟，如外顯子組測(cè)序(exome sequencing)、拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)和全基因組測(cè)序研究(whole-genome sequencing studies，WGS)，這些技術(shù)的成熟有利于更加復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)。2014年P(guān)eyrard-Janvid等[20]對(duì)一個(gè)Van der Woude綜合征的大家族進(jìn)行了外顯子組測(cè)序，將GRHL3(grainyhead-like3)基因作為其重要候選基因之一，大約有5%的患病是由于GRHL3引起。Bureau等[21]通過患者NSCL/P患兒的二級(jí)和三級(jí)親屬的外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)了他們都具有上皮型鈣黏素(E-cadherin，CDH1)基因的突變。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，一些其他少見的突變都是通過作用于CDH1基因發(fā)揮作用，因此CDH1基因也已經(jīng)成為重要的候選基因之一[22,23]

在Maarse等[24]在系統(tǒng)回顧中闡明CNV已經(jīng)逐漸成為研究NSCL/P的一個(gè)重要方法。Younkin等[25,26]也利用CNV陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了ch7p14.1、ADAM3A、MGAM和ADAM5A等具有研究潛力的基因。

唇腭裂的基因研究迅速發(fā)展，目前已經(jīng)可以使用標(biāo)準(zhǔn)化工具研究復(fù)雜的遺傳規(guī)律?？梢源_定的是，唇腭裂的發(fā)病有明確的基因基礎(chǔ)，但是肯定涉及非常多的基因，并且與環(huán)境因素密切相關(guān)。近幾年，無論是技術(shù)水平還是統(tǒng)計(jì)方法均快速發(fā)展，但是在病因不一致性的研究方面總是力不從心，特別是對(duì)一些少見畸形更是如此。目前的技術(shù)已經(jīng)可以做到完整的基因組測(cè)序，但是，詳細(xì)恰當(dāng)?shù)脑O(shè)計(jì)和有效的分析仍然是最重要的。

唇腭裂基因方面最大的挑戰(zhàn)在于沒有一個(gè)有效方法去處理龐大而復(fù)雜的數(shù)據(jù)。盡管可以對(duì)患者的家族進(jìn)行追蹤、繪制遺傳圖并進(jìn)行基因測(cè)序，但是如何處理、分析、解釋獲得的生物信息卻非常困難。特別是一對(duì)特定的夫妻可能在多個(gè)基因位點(diǎn)上存在多個(gè)變異，如何將獲得的基因信息轉(zhuǎn)化為有效的臨床工具極其困難，具體的預(yù)防和和治療時(shí)機(jī)也很難把握。