鄧麗麗，劉亞男，喻道軍，鄧志平*

（1.沈陽醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院實驗教學中心，遼寧 沈陽100034；2.衛(wèi)生檢驗教研室）

果醋含有豐富的有機酸、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)，具有食療保健、美白護膚、抗病、抗衰老等功能，被譽為“21世紀的食品”［1］。隨著生活水平的提高，果醋越來越受到人們的廣泛關(guān)注。大量研究表明，醋酸菌是影響果醋釀造質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素［2-4］，我國目前釀醋用的菌種存在產(chǎn)酸不理想、耐酒精能力不高、風味欠佳等問題，因此培育和篩選適合果醋生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)醋酸菌對于果醋釀造工業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

獼猴桃被譽為“水果之王”、“維C之冠”，近年來其保健功能和藥用價值越來越受到關(guān)注［5-6］，但獼猴桃屬于后熟果實，加工運輸和果實儲藏方面仍存在不少問題，而對獼猴桃進行深加工，制作果醋，既能充分利用其中的營養(yǎng)價值，又能有效減少獼猴桃因儲藏期短而造成的經(jīng)濟損失。有研究顯示，醋酸菌是一種常見細菌，廣泛分布于蘋果、葡萄、紅棗等新鮮水果中［7-8］。因此，本文擬從獼猴桃中分離和篩選出優(yōu)質(zhì)醋酸菌，以期用于獼猴桃果醋的生產(chǎn)釀造工業(yè)中，從而為生產(chǎn)高質(zhì)量、風味佳的獼猴桃果醋提供優(yōu)質(zhì)的菌種來源。

1 材料與方法

1.1 材料 超市挑選色澤均勻、果實飽滿、無破碎傷口新鮮獼猴桃（四川省蒼溪縣中華獼猴桃）。

1.2 培養(yǎng)基［9］（1）增殖培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母浸粉1%，KH2PO40.5%，pH 5.5，115℃滅菌30 min，滅菌后冷卻至70℃時，加入3%無水乙醇。（2）基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母浸粉1%，pH 5.5，115℃滅菌30 min，滅菌后冷卻至70℃時，加入3%無水乙醇。（3）鈣平板分離培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基）：葡萄糖1%，酵母浸粉1%，CaCO31%，瓊脂1.5%，115℃滅菌30 min，滅菌后冷卻至70℃，加入3%無水乙醇。（4）1#發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母浸粉0.5%，KH2PO40.06%，硫酸鎂0.04%，pH 5.5，115℃滅菌30 min。（5）2#發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母浸粉0.5%，KH2PO40.06%，硫酸鎂0.04%，pH 5.5，115℃滅菌30 min，滅菌后冷卻至70℃，加入3%無水乙醇。（6）產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母浸粉0.5%，KH2PO40.06%，硫酸鎂0.04%，pH 5.5，115℃滅菌30 min，滅菌后冷卻至70℃，加入3%無水乙醇。

1.3 試劑 酵母粉、瓊脂購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、冰醋酸、氫氧化鈉、氯化鐵、甘油等購自國藥集團化學試劑有限公司；酚酞購自西隴科學股份有限公司；革蘭染液購自青島海博生物。

1.4 儀器與設(shè)備 高速離心機HC-3014（科大創(chuàng)新中佳公司）；超低溫冰箱MDF-U53V（日本PANASONIC公司）；pH計（上海精密科學儀器有限公司）；SX-500壓力蒸汽滅菌器（日本東京TOMY公司）；振蕩培養(yǎng)箱ZDP-150（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；OLYMPUS CX21FS1生物顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 樣品制備 挑選色澤均勻、果實飽滿、無破碎傷口的獼猴桃200 g（無需去皮），將其榨汁后用干凈紗布進行過濾，除去果皮、果肉等固型顆粒物。取20 ml裝入50 ml的三角瓶中，密封，30℃靜置1周，待醋酸味濃郁時放入4℃冰箱中冷藏備用。

1.5.2 增殖培養(yǎng) 取5 ml獼猴桃汁加入含有50 ml增殖培養(yǎng)基的100 ml三角瓶中，混勻，30℃，120 r/min搖床上培養(yǎng)2 d。

1.5.3 分離、純化及初篩 取上述增殖培養(yǎng)基1 ml，加入9 ml無菌生理鹽水中，依次進行10倍濃度梯度稀釋，制成濃度為10-1～10-7的稀釋液，取10-5、10-6、10-7稀釋液0.2 ml在鈣平板分離培養(yǎng)基上進行涂布，每種稀釋液3個平行樣本，30℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～4 d。部分菌落能夠產(chǎn)生透明圈，說明該菌能夠產(chǎn)酸并降解CaCO3，可能是醋酸菌。挑取菌落形態(tài)一致，透明圈直徑與菌落直徑之比（HC值）［10］較大的單菌落，平板劃線法接種于鈣平板分離培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2～4 d，進一步分離純化［11］。

1.5.4 產(chǎn)酸定性鑒定 將初篩選出的菌株接種于含5 ml基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中，30℃，120 r/min搖床上培養(yǎng)2～3 d，然后吸取4.5 ml于離心管中，5 000 r/min離心5 min去除菌體細胞，再吸取4 ml上清液于小燒杯中，用0.1 mol/L的NaOH溶液中和至pH為7.0。將其移入試管后，并滴加5滴配制好的5%FeCl3溶液，放入沸水浴中加熱，觀察是否形成紅褐色沉淀［12］，若形成紅褐色沉淀，則初步鑒定為醋酸菌。

1.5.5 產(chǎn)酸量測定［13］將初篩得到的菌株，分別挑取一環(huán)接種于含20 ml產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基的50 ml三角瓶中，每組3個平行樣本，在恒溫震蕩搖床上，120 r/min培養(yǎng)2 d后，取2 ml發(fā)酵液，加入含50 ml蒸餾水的100 ml三角瓶中，滴加3～5滴酚酞指示劑，用標定的0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至淺粉色。記錄每個菌株所消耗的NaOH溶液體積。消耗NaOH溶液最多的菌株即為產(chǎn)酸量最高的菌株，根據(jù)以下方法計算出其產(chǎn)酸量：產(chǎn)酸量（g/L）=（V-V0）×CNaOH×60/L［11］，式中：V為發(fā)酵液樣品滴定耗用的NaOH毫升數(shù)；V0為以空白培養(yǎng)基為對照滴定耗用的NaOH毫升數(shù)；CNaOH為NaOH溶液的濃度（mol/L）；L為樣品的毫升數(shù)；60為醋酸的分子量。

1.5.6 耐乙醇性能檢驗 將復篩中選出的產(chǎn)酸性能最好的菌株L2，接種于含50 ml液體培養(yǎng)基的100 ml三角瓶中，在30℃120 r/min搖床上培養(yǎng)2 d后，獲得種子液。然后用平板菌落計數(shù)法測定菌液濃度作為初始濃度對照。然后將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接入乙醇含量分別為3%、5%、7%、9%、11%的1#發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)3 d后，分別用平板菌落計數(shù)法測定菌液濃度。平板菌落計數(shù)法：從10-1梯度稀釋至10-6，均取0.1 ml菌液進行均勻涂布。每個乙醇稀釋梯度取10-3、10-4、10-5三個梯度，每個梯度3個重復，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄其菌落數(shù)。

1.5.7 耐醋酸性能檢驗 將復篩中選出的產(chǎn)酸性能最好的菌株L2，進行種子液培養(yǎng)，做空白對照。將種子液按10%接種量接種于醋酸含量分別為10、20、30、40、50 g/L的2#發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個醋酸濃度3個平行樣本。30℃靜置培養(yǎng)3 d后分別用平板菌落計數(shù)法測定其耐醋酸性能。

1.5.8 醋酸菌菌株鑒定［14］形態(tài)特征觀察：觀察菌株的鈣平板分離培養(yǎng)基菌落形態(tài)，對篩選到的菌株進行革蘭染色，在油鏡下觀察菌體細胞的形態(tài)特征。

基因組DNA的提取采用細菌基因組總DNA提取試劑盒（大連寶生物公司），使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3′）和1492R（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增16S rDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測無誤后，PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行純化、測序。

1.5.9 醋酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將菌株序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性比對分析，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［15］，進而確定其種屬地位。

1.5.10 菌種保藏 取菌液0.5 ml和30%的甘油溶液以1∶1比例混合后置于-80℃后進行保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、純化及初篩 共篩選到5株HC值較大的細菌，對其編號L0-L4。并對其進行分離、純化初篩，透明圈結(jié)果及純化篩選菌落見圖1。

經(jīng)初篩共獲得3株透明圈較大（HC＞2）的醋酸菌L0、L2、L3。菌株淡黃色，表面隆起邊緣整齊，均呈橢圓到短桿狀，（0.8～1.2）μm×（1.5～2.5）μm，單生、成對偶爾成短鏈狀分布，細胞端尖或平。通過革蘭染色均為革蘭陰性菌，見圖2。

圖2 油鏡下觀察醋酸菌株L2革蘭染色

2.2 產(chǎn)酸定性鑒定 將初篩得到的5株菌活化并離心之后，進行FeCl3滴定實驗，菌株L0、L2、L3產(chǎn)生了紅褐色沉淀，表明這幾株菌為醋酸菌，菌株L1、L4未產(chǎn)生紅褐色沉淀，表明其不能產(chǎn)生醋酸，見圖3。

圖3 分離菌株產(chǎn)酸定性鑒定

2.3 產(chǎn)酸量測定 將L0、L2、L3 3株菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)后，對其進行滴定，測定其產(chǎn)酸量，結(jié)果L2消耗NaOH溶液最多，產(chǎn)酸量最高，產(chǎn)酸量為3.6 g/L。測出3株菌株的產(chǎn)酸量結(jié)果見表1。

表1 L0、L2、L3 3株菌株產(chǎn)酸量測定結(jié)果

2.4 耐乙醇性能檢驗 當乙醇濃度為3%時，菌株L2的菌落總數(shù)達到最大值，為1.5×107CFU/ml；當乙醇濃度為5%時，菌株L2的菌落總數(shù)高于初始濃度菌落總數(shù)；當乙醇濃度為7%時，菌株L2的菌落總數(shù)低于初始濃度菌落總數(shù)，說明該乙醇濃度抑制了菌株生長；當乙醇濃度為11%時，大多數(shù)菌落無法在此濃度下生長。結(jié)果顯示菌株L2對乙醇的耐受性為5%。

2.5 耐醋酸性能檢驗 當醋酸濃度為1%時，菌株L2的菌落總數(shù)達到最大值，為9.5×106CFU/ml；當醋酸濃度為2%時，菌株L2的菌落總數(shù)開始低于初始濃度菌落總數(shù)，說明此醋酸濃度影響菌體生長；當醋酸濃度為5%時，大多數(shù)菌體無法正常生長。結(jié)果顯示菌株L2對醋酸的耐受性為1%。

2.6 分離菌株的分子生物學鑒定 提取菌株L0、L2、L3的全基因組，使用通用引物27F和1492R擴增其16S rDNA序列，對全基因組DNA和PCR擴增的16S rDNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4。

圖4 菌株基因組總DNA及16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.7 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 在NCBI上將3株菌株的16S rDNA序列進行BLAST同源序列比對，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。見圖5。分離得到的3株醋酸菌按照親緣關(guān)系分屬于三個種：蘋果醋桿菌（Acetobacter malorum）：L0；桃醋酸桿菌（Acetob act er per sici）：L2；芝庇儂醋桿菌（Acetobacter cibinon gens is）：L3。

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本研究通過富集培養(yǎng)和分離純化，從獼猴桃中篩選出了5株HC值較大的菌；然后對這5株菌進行分段劃線，初步篩選出3株優(yōu)勢純菌株；對篩選出的菌株進行產(chǎn)酸定性鑒定，其中菌株L0、L2、L3產(chǎn)生了紅褐色沉淀，說明這三株菌均為醋酸菌；并對其進行革蘭染色和形態(tài)特征觀察，其中L0、L2、L3為球桿狀革蘭陰性菌；將篩選出的3株醋酸菌進行產(chǎn)酸性能測定，發(fā)現(xiàn)菌株L2的產(chǎn)酸量最高，達到了3.6 g/L；再對菌株L2進行耐乙醇、耐醋酸性能測定，得到菌株L2對乙醇的耐受性為5%，對醋酸的耐受性為1%。通過對這3株菌進行分子生物學鑒定，發(fā)現(xiàn)分離得到的3株醋酸菌分屬于3個種：蘋果醋桿菌（Acetobacter malorum）：L0；桃醋酸桿菌（Acetob acter persici）：L2；芝庇儂醋桿菌（Acetob act er cibinon gens is）：L3。優(yōu)良的醋酸菌菌種是影響果醋品質(zhì)的關(guān)鍵因素，本實驗從獼猴桃中篩選鑒定了3株醋酸菌，豐富了獼猴桃果醋制作工藝中醋酸菌來源，不過與蘋果、葡萄等果醋醋食品生產(chǎn)標準菌比較，本實驗分離得到的獼猴桃醋酸菌產(chǎn)酸能力有待提高，但作為果醋生產(chǎn)的重要來源，有必要進行更進一步培養(yǎng)發(fā)酵條件的探索，或者遺傳誘變選育，以獲得更適合用于獼猴桃果醋生產(chǎn)加工的醋酸菌。