施夏明，齊璐璐，喬寧寧，徐忠東，耿明

（1.合肥師范學(xué)院，安徽合肥230601；2.安徽大學(xué)，安徽合肥230039）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是無(wú)性繁殖作物，病毒和類病毒可通過(guò)種薯持續(xù)傳播給子代植株[1]，這是制約馬鈴薯現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量下降的主要因素。馬鈴薯X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、S病毒（PVS）、卷葉病毒（PLRV）、M 病毒（PVM）、A病毒（PVA）在我國(guó)及世界各地廣泛流行。我國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)PVS、PVY感染情況尤為嚴(yán)重[2]。馬鈴薯病毒脫毒技術(shù)對(duì)于提高馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要?，F(xiàn)行的馬鈴薯脫毒技術(shù)主要包含莖尖分生組織培養(yǎng)法、熱療法、電療法、化學(xué)療法、冷凍療法。單獨(dú)或聯(lián)合使用上述方法，均取得了良好的脫毒效果。筆者綜述了國(guó)內(nèi)外馬鈴薯脫毒技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，為馬鈴薯脫毒技術(shù)的研究和推廣提供參考。

1 莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)

植物病毒通過(guò)在維管系統(tǒng)中的快速移動(dòng)來(lái)侵染健康組織，而在未形成成熟維管系統(tǒng)的分生組織中，病毒只能在胞間連絲上緩慢傳輸來(lái)侵染組織[3]。此外，細(xì)胞分裂和病毒復(fù)制存在激烈競(jìng)爭(zhēng)。在分生組織中，細(xì)胞分裂非常旺盛，需要消耗大量養(yǎng)分，而病毒復(fù)制由于得不到充足的營(yíng)養(yǎng)而受到明顯抑制[4]。因此，植物的分生組織不含病毒。將植物的分生組織分離出來(lái)，進(jìn)行組織培養(yǎng)即可得到無(wú)病毒的脫毒苗。莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的一種脫毒方法。近年來(lái)，馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)的發(fā)展研究主要集中在不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的莖尖脫毒培養(yǎng)基配方及莖尖剝離方式上[5-7]。莖尖脫毒培養(yǎng)基配方研究除了聚焦使用什么樣的激素及其配比來(lái)提高脫毒莖尖成活率外，還關(guān)注如何提高脫毒莖尖的成苗率。齊恩芳等在莖尖脫毒培養(yǎng)基中添加了0.05%活性炭，莖尖成苗時(shí)間提前了13 d，成苗率提升了7.5%[8]。盧艷麗等在莖尖培養(yǎng)基中添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽，顯著抑制了組織褐變，且提高了成苗率[9]。

2 熱療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

熱療法的2個(gè)重要影響因素是溫度和熱療時(shí)間。熱療的原則是不損傷植物組織，但可以使植物病毒的衣殼蛋白變性，從而最大限度地殺死病毒。此外，熱療法還可能通過(guò)預(yù)防病毒向分生組織細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、抑制病毒復(fù)制、降解病毒RNA、促進(jìn)病毒RNA沉默、減少莖尖中病毒基因組積聚等方式來(lái)實(shí)現(xiàn)植物脫毒[10]。熱療法對(duì)馬鈴薯卷葉病毒最敏感[11]。Abbas等利用37℃熱水浸泡馬鈴薯塊莖2～3 h后，轉(zhuǎn)入大田播種，卷葉病毒發(fā)病率降至最小16.66%[12]。熱療法對(duì)其他馬鈴薯病毒，例如PVX、PVS也具有不同程度的抑制作用[13]。熱療法常常配合莖尖分生組織培養(yǎng)，可以顯著提高脫毒效率[10]。蔣瑜等對(duì)國(guó)際馬鈴薯中心提供的編號(hào)B13-6的發(fā)芽馬鈴薯塊先進(jìn)行37℃熱療30 d，然后進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)，結(jié)果顯示熱療可提高脫毒效果[14]。馮光惠等對(duì)含有PVX、PVY、PLRV、PSTVd（馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒）4種病毒的費(fèi)烏瑞它、夏波蒂馬鈴薯無(wú)菌苗先進(jìn)行每天38℃熱療4 h，持續(xù)4周，然后進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)，結(jié)果表明PLRV的脫除率均達(dá)到100%，PVX的脫除率均達(dá)到65%以上，PVY的脫除率均達(dá)到90%以上，最難脫除的類病毒PSTVd的脫除率也達(dá)到8%以上[15-16]。尹明華等采用莖尖培養(yǎng)與熱療法反復(fù)交互進(jìn)行，成功脫除了懷玉山地區(qū)高山馬鈴薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒[6]。

3 電療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

電療法是一種高效、簡(jiǎn)便、快速的脫毒技術(shù)方法。其通常將馬鈴薯莖尖、莖段、芽等外植體置于5～100 mA 的電流下，通電處理 5～25 min，然后移入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可在不影響外植體再生率的基礎(chǔ)上，較好地脫除病毒。電療法脫病毒的原理可能是通過(guò)電脈沖加熱植物組織，使病毒的核酸變性，從而達(dá)到殺滅病毒的療效[17-18]。馬鈴薯電療法脫毒技術(shù)在我國(guó)的運(yùn)用并不多見，而在國(guó)外，此技術(shù)方法的運(yùn)用較為廣泛。國(guó)外學(xué)者運(yùn)用此方法已成功脫除PVX[17，19]、PVY[20-23]、PLRV[23-24]、PVA[21]、PSTVd[24]。

4 化學(xué)療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

化學(xué)療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)采用的化療藥物最常見的是利巴韋林。利巴韋林在1972年被人工合成，試驗(yàn)證據(jù)表明其可以抑制大多數(shù)動(dòng)物RNA病毒和DNA病毒的復(fù)制，是高效的抗病毒藥物[25]。1982年Klein等為了獲取無(wú)PVX種苗，利用添加了利巴韋林的液體培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)馬鈴薯莖尖，結(jié)果顯示10 μg/mL利巴韋林可以脫除80%～83%莖尖的PVX，6～8個(gè)月后莖尖發(fā)育成完整的植株。但是各種濃度的利巴韋林對(duì)植物生長(zhǎng)均可產(chǎn)生毒害作用，當(dāng)利巴韋林的濃度達(dá)到 100 μg/mL 時(shí)，致死莖尖[26]。2008 年 Dhital等利用添加了20 mg/L利巴韋林的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)電療過(guò)后的馬鈴薯莖尖，相對(duì)于單一電療法，顯著增加了PLRV和PVY的脫毒率[23]。2014年Yang等將各自感染了 PVA、PLRV、PVS、PVX、PVY 的馬鈴薯小植株和混合感染了PVM、PVS、PVY的馬鈴薯小植株培養(yǎng)在含有不同濃度利巴韋林的MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)2～3代的繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)75～150 mg/L利巴韋林可以高頻獲取脫毒種苗[27]。2015年Singh等將PLRV陽(yáng)性的馬鈴薯外植體培養(yǎng)在含有5～30 mg/L利巴韋林的MS培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示隨著利巴韋林濃度的增加，馬鈴薯植株的再生率顯著降低，脫毒率顯著增加，當(dāng)利巴韋林濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，再生率和脫毒率達(dá)到了最佳組合，再生率達(dá)到36.80%，脫毒率達(dá)到39.62%[28]。2017年Kushnarenko等將馬鈴薯莖尖冷凍處理后，再用含有利巴韋林的培養(yǎng)基培養(yǎng)3代，獲得了100%無(wú)毒馬鈴薯苗[29]。以上研究表明利巴韋林對(duì)廣泛流行的6種馬鈴薯病毒均有不同程度的抑制作用。

化學(xué)療法脫毒技術(shù)采用的化療藥物除了利巴韋林外，還有一些其他藥物的應(yīng)用實(shí)例，例如1 000 mg/L乳鐵蛋白通過(guò)噴霧法或者聯(lián)合組織培養(yǎng)法可有效抑制PVX[30]。富含25 mg/L 2-硫尿嘧啶的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)卷葉病毒陽(yáng)性的馬鈴薯外植體，可得到30.55%的再生率和38.68%的脫毒率[28]。此外還有些化療藥物在脫毒的同時(shí)幫助提升植株的再生率，例如水楊酸預(yù)處理聯(lián)合冷凍療法可增強(qiáng)馬鈴薯植株的存活率并可清除PVS[31]。水楊酸聯(lián)合利巴韋林和電療法在有效清除PLRV和PVY的同時(shí)，顯著提升馬鈴薯苗的再生率，最高達(dá)72.7%[23]。

5 冷凍療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

相對(duì)于傳統(tǒng)的莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)，冷凍脫毒培養(yǎng)是一種更高效、更簡(jiǎn)便的脫毒培養(yǎng)技術(shù)[32]。植物病毒量會(huì)隨著離頂端分生組織距離的減小而減少。頂端分生組織的細(xì)胞含有高濃度胞質(zhì)，而距離分生組織較遠(yuǎn)的莖尖細(xì)胞含有較多水分。在-196℃的冰凍條件下，水分含量大的細(xì)胞會(huì)被胞內(nèi)形成的冰晶崩解，而擁有高濃度胞質(zhì)的細(xì)胞可以抵抗冰凍。因此，低溫療法是基于超低溫對(duì)細(xì)胞選擇性破壞的原理，殺死帶有病毒且水分含量大的莖尖細(xì)胞，保存不含病毒或含少量病毒的分生組織細(xì)胞，結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)，而得到無(wú)毒種苗[33-34]。目前，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家已采用馬鈴薯冷凍療法脫毒技術(shù)成功高效脫除了PVM、PVX、PVY、PVS、PLRV、PSTVd[29，31，35-39]。

6 結(jié)語(yǔ)

馬鈴薯品種繁多，馬鈴薯病毒的種類亦繁多。每一品種馬鈴薯感染的每一種病毒對(duì)每一種脫毒技術(shù)的敏感性均有不同，這就需要研究者深入尋找最佳的脫毒方案。此外，每一種脫毒技術(shù)均具有一定的局限性，需要研究者聯(lián)合2種或更多種的脫毒技術(shù)同時(shí)干預(yù)馬鈴薯病毒，使脫毒技術(shù)間優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，才能獲得理想的馬鈴薯脫毒種質(zhì)。例如，科學(xué)家運(yùn)用莖尖分生組織脫毒技術(shù)、冷凍脫毒技術(shù)、化學(xué)療法聯(lián)合熱療法脫毒技術(shù)分別對(duì)挪威當(dāng)?shù)?種傳統(tǒng)栽培品種馬鈴薯進(jìn)行脫毒試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)品種的馬鈴薯通過(guò)莖尖分生組織脫毒技術(shù)脫除病毒，沒(méi)有1個(gè)品種的馬鈴薯通過(guò)冷凍脫毒技術(shù)脫除病毒，而8個(gè)品種的馬鈴薯均通過(guò)化學(xué)療法聯(lián)合熱療法不同程度地脫除了病毒[40]。

馬鈴薯是全球第4大糧食作物，我國(guó)是最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)[41]。我國(guó)已啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略。馬鈴薯種質(zhì)資源的脫毒情況嚴(yán)重影響我國(guó)馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)及糧食安全。因此，簡(jiǎn)便易行、安全高效、脫毒周期短的脫毒技術(shù)研究和推廣是馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的必然要求。