李長(zhǎng)青

（新鄭市人民醫(yī)院新生兒科，河南新鄭451100）

支氣管哮喘是最常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病之一，發(fā)病率每年都在上升。一些研究表明，維生素D的差異與哮喘兒童的狀態(tài)存在一定的聯(lián)系，維生素D 對(duì)哮喘的免疫調(diào)節(jié)功能具有全面的預(yù)防作用，但具體機(jī)制還不太明確［1］。microRNA-126（miR-126） 是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性微小核糖核酸（microRNA,miRNA），在呼吸系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及心血管再生中表達(dá)［2］。在用卵清蛋白致敏的慢性哮喘模型中，miR-126 在氣道中高表達(dá)；相反，通過(guò)長(zhǎng)期施用拮抗劑抑制miR-126 的表達(dá)，可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞募集到氣道中［3］。本研究擬檢測(cè)支氣管哮喘患兒血清25-羥維生素D3［25-OH-VitD3，25(OH)D3］水平與血清及支氣管肺泡灌洗液中microRNA-126 水平，分析25(OH)D3、microRNA-126 在支氣管哮喘中作用和機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017 年1 月至2019 年1 月在該院接受治療的51 例支氣管哮喘患兒（哮喘組）作為研究對(duì)象，其中男36 例，女15 例；年齡1～9（6.7±1.1）歲。所有患兒均符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除伴有嚴(yán)重心肝腎疾病的患兒，排除1 個(gè)月內(nèi)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素以及近3 個(gè)月服用維生素D 的患兒。所有患兒依據(jù)血清25(OH)D3水平分為3 組，維生素D 適當(dāng)組（＞30 ng/ml,n=7）、不足組（20～30 ng/ml,n=14）和缺乏組（＜20 ng/ml,n=30）。同期選擇15 例因支氣管異物接受治療的患兒為對(duì)照組，其中男11 例，女4 例；年齡1～9（6.5±1.2）歲。哮喘組和對(duì)照組患兒的性別、年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。研究前，患兒家屬均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集

①所有哮喘患兒采取左肺舌葉病變采集支氣管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid,BALF），對(duì)照組選擇非異物側(cè)肺進(jìn)行灌洗。BALF離心后，上清液置于-70℃保存。②所有患兒入院后均采集空腹血4 ml，3 000 rpm 5 min，取血清置于-70℃保存。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法檢測(cè)各組患兒血清25(OH)D3水平。

1.3 血清及BALF 中miR-126 水平測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）確定miR-126 相對(duì)水平。TRIzol 試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用CFX-96 PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-rad 公司），U6 作為內(nèi)部參考基因。引物序列由上海英駿公司提供。miR-126 上游序列：5'-GCTGGCGACGGGACATTATTA-3'，下游序列：5'-CCGTGGACGGCGCATTATTA-3'，產(chǎn)物82 bp。反應(yīng)體系總共為20 μl：10 μl SYBR 預(yù)混物Ex Taq?（2x），2 μl PCR 上游引物（5 μmol/L），2 μl PCR 下游引物（5 μmol/L），2 μl 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和4 μl 無(wú)RNA 聚合酶的水。反應(yīng)進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)，變性發(fā)生在95℃30 s，然后退火55°C 30 s，72°C 延伸30 s。采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較目的基因水平。

1.4 肺功能檢測(cè)

采用英國(guó)比特勒肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)最大呼氣流量（peak expiratory flow,PEF）、第1 秒用力呼氣容積 （forced expiratory volume in one second,FEV1），并計(jì)算第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比（FEV1%）和FEV1/用力肺活量（forced vital capacity,FVC）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多組間比較采用one-way ANOVA 分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 進(jìn)行相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 血清miR-126、25(OH)D3 水平以及BALF中miR-126 比較

哮喘組血清25(OH)D3明顯低于對(duì)照組、血清miR-126、BALF miR-126 明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 不同血清25(OH)D3水平患兒血清miR-126、BALF miR-126 水平比較

各組患兒的血清25(OH)D3、miR-126 以及BALF miR-126 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中缺乏組、不足組、適當(dāng)組血清miR-126、BALF miR-126 水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），缺乏組、不足組miR-126、BALF miR-126 水平明顯高于適當(dāng)組（P＜0.05），而缺乏組明顯高于不足組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 不同血清25(OH)D3水平患兒肺功能比較

各組患兒的PEF、FEV1% 以及FEV1/FVC 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中缺乏組、不足組、適當(dāng)組PEF、FEV1% 以及FEV1/FVC 水平明顯低于于對(duì)照組（P＜0.05），缺乏組、不足組PEF、FEV1%以及FEV1/FVC 水平明顯低于適當(dāng)組（P＜0.05），而不足組明顯低于適當(dāng)組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 相關(guān)性分析

血清25(OH)D3水平與BALF 中miR-126 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.521,P＜0.05），與PEF、FEV1%、FEV1/FVC 呈正相關(guān)（分別r=0.478、0.432、0.501,P＜0.05）。

表1 血清miR-126 和25(OH)D3水平比較 （±s）

表1 血清miR-126 和25(OH)D3水平比較 （±s）

BALF miR-126 3.47±0.49 7.22±2.59 5.549 0.000組別對(duì)照組哮喘組t值P值例數(shù)15 51血清25(OH)D3/(ng/ml)38.54±6.43 19.21±5.96 10.849 0.000血清miR-126 3.46±0.52 6.24±1.46 7.207 0.000

表2 不同血清25(OH)D3水平患兒血清miR-126、BALF miR-126 水平比較 （±s）

表2 不同血清25(OH)D3水平患兒血清miR-126、BALF miR-126 水平比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與適當(dāng)組比較，P ＜0.05；3）與不足組比較，P ＜0.05。

BALF miR-126 3.47±0.49 5.16±1.141)6.06±1.251)2)8.98±1.481)2)3)31.476 0.000組別對(duì)照組適當(dāng)組不足組缺乏組F值P值例數(shù)15 7 14 30血清25(OH)D3/(ng/ml)38.54±6.43 32.81±0.841)24.54±2.741)2)15.63±1.761)2)3)155.600 0.000血清miR-126 3.46±0.52 4.78±1.081)5.29±1.231)2)7.25±1.331)2)3)39.340 0.000

表3 不同血清25(OH)D3水平肺功能比較 （±s）

表3 不同血清25(OH)D3水平肺功能比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與適當(dāng)組比較，P ＜0.05；3）與不足組比較，P ＜0.05。

FEV1/FVC 87.22±1.82 79.26±1.351)73.58±1.521)2)70.18±1.221)2)3)2 487.331 0.000組別對(duì)照組適當(dāng)組不足組缺乏組F值P值例數(shù)15 7 14 30 PEF/(L/min)89.27±1.07 71.28±1.421)64.38±1.091)2)50.33±1.581)2)3)2 771.000 0.000 FEV1%/%84.25±1.11 79.28±1.361)76.24±1.471)2)69.46±1.571)2)3)2 548.358 0.000

3 討論

哮喘的特征是慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和不可逆的氣道重塑，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚［4］。目前的哮喘治療主要依靠長(zhǎng)期吸入糖皮質(zhì)激素［5］。雖然糖皮質(zhì)激素能緩解支氣管哮喘，但他們無(wú)法控制涉及荷爾蒙的難治性哮喘抵抗和激素依賴性。此外，糖皮質(zhì)激素易引起副作用，如生長(zhǎng)和發(fā)育抑制、肥胖［6］。因此，迫切需要進(jìn)一步了解哮喘的發(fā)病機(jī)制，并找出治療氣道炎癥的新方法。目前的研究顯示，合適的循環(huán)維生素D 水平對(duì)患兒具有保護(hù)作用，能有效地減少哮喘［7］。一些流行病學(xué)研究表明，妊娠期母親維生素D 攝入量低與后代喘息表型風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［8］。本研究中，哮喘組患兒的血清25(OH)D3水平明顯低于對(duì)照組，這說(shuō)明哮喘患兒普遍存在維生素D 不足或缺乏。而且通過(guò)相關(guān)性分析也顯示，25(OH)D3水平與PEF、FEV1%、FEV1/FVC 呈正相關(guān)，提示25(OH)D3參與了哮喘的發(fā)生和進(jìn)展。

微小RNA（miRNA）為一類小的非編碼RNA分子，能夠識(shí)別特定的靶信使RNA（mRNA）并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平，作為免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)者［9］。 microRNA-126 定位于染色體9q34.3，在肺和心臟組織中高表達(dá)，尤其在內(nèi)皮細(xì)胞上能鑒定出microRNA-126 的高表達(dá)水平，其可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）途徑調(diào)節(jié)血管生成和血管完整性［10］。一些研究指出，miR-126 在過(guò)敏性呼吸系統(tǒng)疾病中異常表達(dá)，尤其哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞中miR-126 的表達(dá)水平明顯上調(diào)，并與白細(xì)胞介素（interleukin,IL）-13 呈現(xiàn)相關(guān)性，可以促進(jìn)細(xì)胞因子IL-13 水平的升高，這表明miR-126可以作為一個(gè)相關(guān)因素進(jìn)行研究［11］。而且改變miR-126 已被證明可以改善治療后的效果，這也表明miRNA 的變化對(duì)哮喘癥狀持續(xù)存在至關(guān)重要［12］。本研究中，哮喘組患兒的miR-126 相對(duì)水平明顯高于對(duì)照組，表明miR-126 可能參與了哮喘的發(fā)生和進(jìn)展。直線相關(guān)分析顯示，血清25(OH)D3與BALF 中miR-126 呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明25(OH)D3與BALF 中miR-126 共同參與了哮喘的發(fā)生和進(jìn)展。其原因可能是低水平的血清25(OH)D3可能導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥的加劇、外周血和BALF 中miR-126 的相對(duì)水平增加、免疫系統(tǒng)的失衡。結(jié)果炎癥細(xì)胞釋放更多炎癥因子，加重疾病嚴(yán)重程度，這也提示miR-126 可能在促進(jìn)免疫失衡中發(fā)揮作用。

總之，低水平25(OH)D3可能促使miR-126 表達(dá)在哮喘患兒的外周血及BALF 中上調(diào)，并導(dǎo)致免疫失衡，肺功能水平下調(diào)，并與疾病嚴(yán)重程度存在一定的聯(lián)系，因此，miR-126 可用作哮喘輔助診斷和評(píng)估潛在血清學(xué)標(biāo)志物。