李思聰 孫宇輝

(武漢大學藥學院，武漢 430072)

圖1 常見的氨基糖苷類化合物Fig.1 Amino glycoside compounds

氨基糖苷(aminoglycoside)抗生素是以氨基環(huán)醇為母核，并含有氨基糖環(huán)和糖苷鍵為結構特征的一類化合物。1944年，第一例氨基糖苷類抗生素鏈霉素(streptomycin)從灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)中被發(fā)現(xiàn)(圖1)[1]，由于對結核分枝桿菌表現(xiàn)出的優(yōu)良活性，成為當時治療肺結核的特效藥，其發(fā)現(xiàn)者Waksman于1952年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。此后，氨基糖苷類抗生素的發(fā)現(xiàn)、分離與鑒定進入黃金時代，更多的氨基糖苷類抗生素被發(fā)現(xiàn)并應用于臨床，如1949年，Waksman等[2]從弗雷德鏈霉菌(Streptomyces fradiae)中發(fā)現(xiàn)的新霉素(neomycin)；1957年，Umezawa等[3]從卡那霉素鏈霉菌(Streptomyces kanamyceticus)中發(fā)現(xiàn)的卡那霉素(kanamycin)；1963年，Weinstein等[4]從棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)中發(fā)現(xiàn)的慶大霉素(gentamicin)；1967年，Higgins等[5]從黑暗鏈霉菌(Streptomyces tenebrarius)中發(fā)現(xiàn)的妥布霉素(tobramycin)，以及Weinstein等[6]于1970年從伊尼奧小單孢菌(Micromonospora inyoensis)中發(fā)現(xiàn)的西索米星(sisomicin)等(圖1)。盡管結構上各有差異，但它們發(fā)揮作用的基本原理都是通過特異性地結合于細菌核糖體30S小亞基16S rRNA的氨酰-tRNA位點，干擾細菌蛋白質合成，從而表現(xiàn)出對細菌，尤其是革蘭陰性菌優(yōu)異的殺滅活性[7-9]，因此被廣泛應用于臨床治療，對人類的健康做出了極其重要的貢獻。近年來，隨著耐藥性的日益嚴重，氨基糖苷類抗生素通過與β-內酰胺類抗生素的協(xié)同作用，也成為控制多重耐藥菌的重要策略之一[10]。同時，隨著研究不斷深入和拓展，氨基糖苷類抗生素更多新的生物活性被揭示出來，如在抗病毒方面，以慶大霉素為代表的氨基糖苷類抗生素可抑制HIV相關多肽與反式激活響應(trans-activation response,TAR)RNA的結合[11]；慶大霉素及其代謝中間產物G418能夠恢復由無義突變引起的翻譯提前終止(premature termination codon,PTC)，從而激活腫瘤細胞中的抑制因子p53，使腫瘤細胞凋亡[12-13]，這一新發(fā)現(xiàn)賦予了這一傳統(tǒng)藥物在癌癥治療方面的巨大潛力。此外，慶大霉素還可以作為增感劑，通過與喜樹堿、洋地黃毒苷和長春花堿等聯(lián)用，在體外顯著提高對肺癌細胞NCI-H460的抑制和殺滅活性[14]。令人鼓舞的是，2018年6月26日，美國FDA批準Achaogen公司基于西索米星經化學修飾而獲得的plazomicin(商品名ZEMDRITM)用于治療多重耐藥性革蘭陰性菌導致的嚴重感染(圖1)。它能克服多種氨基糖苷鈍化酶對抗生素分子的破壞，是針對多重耐藥性革蘭陰性菌感染的最新一代氨基糖苷類抗生素。這些新活性的揭示，向人們展示出氨基糖苷這一曾經輝煌的經典藥物“寶刀未老”，依然綻放出新的鋒芒。因此，進一步發(fā)掘氨基糖苷抗生素結構和活性的潛力，成為了人們新的期待。

為了深入挖掘氨基糖苷類抗生素的潛力，特別是運用現(xiàn)代合成生物學和代謝工程等方法對其進行結構優(yōu)化和定向改造，全面徹底地闡明其生物合成途徑是實現(xiàn)這一目的的重要前提。在以慶大霉素為代表的基糖苷類抗生素生物合成早期的研究中，美國先靈公司Testa和日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)有限公司Kase等利用傳統(tǒng)理化誘變方法隨機獲得一系列慶大霉素生物合成阻斷突變株，通過對其發(fā)酵產物結構的鑒定和分析，并結合同位素標記前體喂養(yǎng)，推導出慶大霉素可能的生物合成途徑[15-18]。直到進入21世紀，基因組測序技術的快速發(fā)展以及基糖苷類抗生素產生菌遺傳操作系統(tǒng)的突破，大大加速了其生物合成機制探索的進程。來自遺傳學、生物化學及化學生物學，特別是結構生物學的國內外研究進展使其生物合成過程正逐漸清晰，為老藥新用的理性定向改造提供了理論支撐。

根據(jù)氨基糖苷類抗生素結構差異，可將氨基糖苷化合物分為兩大類型，即氨基環(huán)醇(aminocyclitol)型和2-脫氧鏈霉胺(2-deoxystreptamine,2-DOS)型。對于后者，又可根據(jù)母核上的糖環(huán)取代基，分為4,5-二取代型、4,6-二取代型和單取代型。本文將對常見的天然和化學半合成氨基糖苷抗生素生物合成的研究進展進行簡要的概述和總結。

1 氨基環(huán)醇型氨基糖苷抗生素的生物合成

該類型抗生素都具有氨基環(huán)醇的六元碳環(huán)結構，其合成起始化合物均為肌醇(myo-inositol)。由于共有的母體結構，因此這類抗生素的生物合成共用肌醇的生物合成途徑，其生物合成途徑為：肌醇-1-磷酸合酶將葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)催化生成肌醇-1-磷酸(myo-inositol-1-phosphate)。然后在磷酸酶的作用下去磷酸化，產生肌醇[19-21]。肌醇作為合成的起始化合物，參與所有氨基環(huán)醇型氨基糖苷抗生素的生物合成(圖2)。對于該家族最著名的成員——鏈霉素，首先在脫氫酶StrI的作用下，肌醇C-2位羥基被氧化形成鯊肌醇單酮(scyllo-inosose)[22]，隨后氨基轉移酶StsC將羰基轉化為氨基，生成鯊肌醇糖胺(scylloinosamine)[23]。該中間體被磷酸基和脒基修飾，形成鏈霉胍-6-磷酸(streptidine-6-phosphate)。根據(jù)推測，它與一個結構獨特的五元糖環(huán)—鏈霉糖(streptose)相連，形成擬二糖(pseudodisaccharide)結構，再與一個葡萄糖環(huán)相連，形成擬三糖(pseudotrisaccharide)骨架。此外還需要經過脫氫、氨基化和甲基化等多步后修飾才能最終合成鏈霉素(圖2)[24]32.2kDa (StrL)。雖然鏈霉素以鏈霉胺為母核，但在生物合成途徑中，并不直接產生鏈霉胺[25]。此外，如果鏈霉素C-3'位側鏈上的羰基被羥甲基取代，則形成雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin或bluensomycin)，它可能與鏈霉素的生物合成相關聯(lián)[26]。

圖2 氨基環(huán)醇型氨基糖苷抗生素生物合成途徑及其氨基糖苷家族成員Fig.2 Biosynthesis of aminocyclitol and its members

在該家族另一重要成員壯觀霉素(spectinomycin)的生物合成中，根據(jù)Sohng研究組異源表達的研究結果，肌醇的C-1位的羥基被脫氫酶SpcB催化氧化，產生L-肌醇單酮(L-myo-inosose)，然后通過氨基轉移酶SpcS2催化產生L-肌醇糖胺(L-myo-inosamine)，再經過一輪類似的酮基氨基化反應，便產生鏈霉胺的差向異構體2-epi-鏈霉胺(2-epi-streptamine)[21]。而它的N-1和N-3位被甲基轉移酶SpcM修飾，生成放線胺(actinamine)。糖基轉移酶SpcG將放線胺與壯觀糖(spectinose)環(huán)相連，形成擬二糖結構，同時放線胺環(huán)的羥基與壯觀糖C-2'位羰基與形成半縮醛結構，即為壯觀霉素(圖2)[27]。關于其結構單元壯觀糖的合成，根據(jù)推測，SpcD能夠將葡萄糖-1-磷酸活化為成dTDP-葡萄糖，它分別經過脫水酶SpcE、轉氨酶SpcS1和脫氨酶SpcH等蛋白的催化作用，形成dTDP-壯觀糖，隨后被加載至母核[27]。

潮霉素(hygromycin)A也是以肌醇為生物合成前體，但脫氫的位置卻不相同，肌醇C-5位的羥基被脫氫酶Hyg17催化氧化生成5-酮基-肌醇(5-keto-myoinositol)(圖2)，隨后在肌糖轉氨酶Hyg8的催化作用下生成2L-2-氨基-2-脫氫肌醇(2L-2-amino-2-deoxy-neoinositol)，它的兩個羥基與一碳單元形成雙氧橋五元環(huán)之后與核苷類結構單元相連，即為潮霉素A[28]。

福提霉素(fortimicin)具有獨特的母核結構，其中福提霉素B的母核上有兩個氨基以及兩個甲基修飾，而福提霉素A在此基礎上還有氨乙?；揎?。從結構上來看，福提霉素也屬于氨基環(huán)醇家族，其生物合成基因簇雖已報道，但其生物合成途徑目前還難以確定，只有少數(shù)基因，如磷酸轉移酶ForP編碼基因的功能已被闡明，它催化3'-OH的磷酸化，該修飾可能是脫雙羥基的前期步驟[29]。

2 2-DOS型氨基糖苷抗生素的生物合成

此類抗生素以2-DOS為母核，且來源廣泛，在鏈霉菌(Streptomyces)、小單胞菌(Micromonospra)、芽孢桿菌(Bacillus)等不同菌株中，該母核的生物合成過程基本相似。關于2-DOS生物合成途徑的探究最早源于1974年，Reinhart等[30]在對新霉素生物合成途徑研究時，通過同位素標記前體喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)2-DOS來源于D-葡萄糖。隨后Daum等[31]發(fā)現(xiàn)2-脫氧鯊肌醇(2-deoxy-scyllo-inosose,2-DOI)也可以作為中間體參與生物合成。從葡萄糖到2-DOI的生物轉化過程，則是由Kakinuma等[32-33]通過氘代葡萄糖喂養(yǎng)核糖霉素(ribostamycin)產生菌Streptomyces ribosidificus所揭示。Nakayama研究組和Kondo研究組[34-36]分別從沙加霉素(sagamicin)產生菌和丁酰苷菌素(butirosin)產生菌突變株中發(fā)現(xiàn)了2-脫氧鯊肌糖胺(2-deoxy-scylloinosamine,2-DOIA)的積累。另外，Chen等[37]從新霉素和慶大霉素的產生菌發(fā)酵產物中發(fā)現(xiàn)2-脫氧鯊肌糖胺單酮(keto-2-deoxy-scyllo-inosamine，keto-2-DOIA)可作為2-DOS生物合成前體(圖3)。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，對于2-DOS生物合成途徑的揭示也逐漸深入到基因水平。1999年，Kakinuma研究組[38-39]首次從丁酰苷菌素的產生菌Bacillus circulansSANK 72073中克隆出2-DOI合成酶編碼基因btrC，為利用其為探針發(fā)掘和克隆2-DOS類抗生素生物合成基因簇提供了參考序列。隨后，該研究組通過體外蛋白催化鑒定出轉氨酶BtrS是催化2-DOI到2-DOIA氨基轉移關鍵酶[40-41](兩個基因btrN和btrS)。值得注意的是，在keto-2-DOIA到2-DOS的氨基轉移過程中，BtrS同樣可以發(fā)揮其氨基轉移功能[40-41](兩個新基因btrN和btrS)。該現(xiàn)象在新霉素產生菌中也同樣存在，Neo5作為與BtrE高度同源的脫氫酶，參與2-DOIA到keto-2-DOIA的生物催化過程；Neo6作為與BtrS高度同源的氨基轉移酶，同樣可以參與2-DOS生物合成中的兩步氨基轉移反應[42-43]。在不同氨基糖苷類抗生素的2-DOS生物合成途徑中，具有相同功能的酶在結構和催化機理上往往高度相似。但對于2-DOIA脫氫酶，卻存在兩種差異明顯的類型，一種以來自新霉素生物合成途徑的NeoA為代表，它們使用NAD+或NADP+為輔因子[43]，另一種以來自丁酰苷菌素生物合成途徑的BtrN為代表，為radical SAM(S-adenosylmethionine)依賴的脫氫酶，它使用鐵硫簇([4Fe-4S]型)為輔因子[42]。

圖3 2-DOS生物合成途徑及其氨基糖苷家族成員Fig.3 Biosynthesis of 2-DOS and its members

在合成2-DOS母核之后，因C-4或C-5糖基取代的不同可進入不同的2-DOS型氨基糖苷抗生素生物合成途徑(圖3)。其中，巴龍霉胺(paromamine)是眾多2-DOS類抗生素生物合成途徑中的第一個擬二糖。早期，Testa等[15]通過喂養(yǎng)巴龍霉胺，可以恢復西索米星產生菌M.inyoensis的2-DOS營養(yǎng)缺陷型突變株中西索米星的產生；此外，Pearce等[44-45]也發(fā)現(xiàn)在新霉菌和巴龍霉素(paromomycin)產生菌的2-DOS營養(yǎng)缺陷型突變株中喂養(yǎng)巴龍霉胺，可以分別恢復新霉菌和巴龍霉素的產生；同樣，Takeda等[46]也發(fā)現(xiàn)巴龍霉胺也可以參與丁酰苷菌素的生物合成；此后，Goda等[47]通過同位素示蹤標記證實新霉素中C-6'氨基的產生是在巴龍霉胺合成之后。這些研究結果說明巴龍霉胺作為通用的中間體，廣泛地參與2-DOS氨基糖苷類抗生素的生物合成過程。而參與巴龍霉胺生物合成相關基因的克隆和功能研究，則遠遲于此，直至2005年，Kudo等[42-43]通過氨基酸序列分析，才定位了酰苷菌素生物合成基因簇中N-乙酰葡萄糖胺轉移酶BtrM編碼基因，并推測它可能負責在2-DOS上加載葡萄糖胺形成巴龍霉胺。2007年，Spencer研究組最終通過體外蛋白催化實驗，證明BtrM首先催化N-乙酰葡糖糖胺(N-acetylglucosamine)與2-DOS通過糖苷鍵相連，然后去乙酰酶BtrD催化2'-N-乙酰巴龍霉胺(2'-N-acetylparomamine)進行脫乙酰反應，形成巴龍霉胺[48](圖3)。從目前研究結果不難發(fā)現(xiàn)，2-DOS氨基糖苷抗生素從葡萄糖-6-磷酸到2-DOS，再到擬二糖中間體巴龍霉胺這一生物合成途徑在不同的氨基糖苷類抗生素中具有很強的通用性和保守性，自然界天然氨基糖苷終產物結構的多樣性更多來源于后續(xù)豐富的基團修飾。

2.1 4,5-二取代型2-DOS氨基糖苷抗生素的生物合成

該類抗生素的結構特征是2-DOS環(huán)的C-4和C-5位羥基被取代，以糖苷鍵與糖環(huán)相連。以核糖霉素的生物合成途徑為例，由2-DOS經BtrM和BtrD生成的擬二糖巴龍霉胺是該類抗生素生物合成途徑中的重要前體，它通過脫氫酶BtrQ和轉氨酶BtrB的依次作用，C-6'位的羥基轉化為氨基，合成新霉胺(neamine)[49]，再通過磷酸核糖轉移酶BtrL與磷酸酶BtrP的依次作用，其C-5位與核糖連接，生成核糖霉素[50]。而核糖霉素的C-3''位羥基通過脫氫酶BtrE和還原酶BtrF的連續(xù)作用，立體構型翻轉，成為木糖菌素(xylostasin)[51]。值得注意的是，核糖的活化方式較為特殊，并非形成dNDP形式，而是形成磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)。核糖霉素和木糖菌素的2-DOS環(huán)N-1位點均可被4-氨基-2-羥基丁酰(4-amino-2-hydroxybutyric acid,AHBA)修飾，分別生成丁酰苷菌素的B和A組分。由于其優(yōu)異的活性，AHBA早在20世紀70年代便成為人們通過化學半合成對天然氨基糖苷類抗生素進行修飾的重要側鏈基團，以獲得具有更好活性的氨基糖苷類抗生素衍生物。而AHBA的生物合成相關基因簇直到本世紀初才被揭示[50]，該基因簇包含7個基因：btrIbtrJ-btrK-btrO-btrV-btrH-btrG。Spencer研究組[52]在體外成功構建了一條包含5個關鍵酶：?；d體蛋白BtrI、ATP-依賴型連接酶BtrJ、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)依賴型脫羧酶BtrK、雙組分黃素依賴型單加氧酶BtrO和BtrV，可合成AHBA側鏈供體γ-L-Glu-AHBA-S-BtrI的生物合成途徑。隨后，他們又在體外完成了經?；D移酶BtrH催化，將γ-L-Glu-AHBA-S-BtrI加載至核糖霉素擬三糖骨架上，并在一特殊的γ-谷氨酰環(huán)化轉移酶的作用下脫去γ-谷氨酰生成丁酰苷菌素B[53]，最終揭示了丁酰苷菌素中AHBA側鏈的生物合成與加載途徑。在破解了AHBA的生物合成途徑后，他們將化學合成的AHBA側鏈供體的模擬底物γ-L-Glu-AHBA-SNAC，在上述BtrH與γ-谷氨酰環(huán)化轉移酶的共同催化下，嘗試加載至不同的天然氨基糖苷類抗生素上，并最終生成一些列具有“非天然”AHBA側鏈的氨基糖苷類抗生素衍生物[54]。研究還發(fā)現(xiàn)BtrH在體外催化AHBA加載至其它2-DOS氨基糖苷類化合物上的過程中，表現(xiàn)出利用非天然底物γ-L-Glu-AHBA-SNAC較其天然底物γ-L-Glu-AHBA-S-BtrI更高的催化效率。

如果核糖霉素沒有被AHBA修飾，而是經過糖基轉移酶NeoF和去乙酰酶NeoD的催化，核糖環(huán)C-3''位與葡萄糖胺相連，則可生成擬四糖骨架[55]，它的C-6'位羥基經過脫氫酶NeoQ和轉氨酶NeoB作用成為氨基[49]，即為新霉素C。值得一提的是，在新霉素系列產物合成過程中，NeoQ和NeoB分別是BtrQ和BtrB的同源蛋白，它們也負責C-6'位的氨基化[49]。而新霉素C的C-5'位立體構型經過NeoN催化后翻轉，生成新霉素B。在此，NeoB僅識別C-5'為S構型底物，特異性強，而NeoN則是radical SAM依賴的差向異構酶[56]，其機理較為特殊，與常見的磷酸吡哆醛依賴型異構酶有明顯差異。新霉素B有多種類似物，其中巴龍霉素與其之間差異在于C-6'位為羥基而非氨基，在其生物合成過程中，ParQ和ParB分別為NeoQ和NeoB的同源蛋白，但它們的功能卻有差異，ParQ和ParB只能負責C-6'位氨基化，無法完成C-6'位的修飾[57]。利維霉素(lividomycin)B則在巴龍霉素的結構基礎上，C-6'位構型翻轉，此外它還缺失了C-3'位羥基，這可能源自脫水酶LivW和還原酶LivY所負責的脫氧[57]。另一方面，利維酶素A則比新霉素B多了一個甘露糖環(huán)結構，這一修飾可能源于某個糖基轉移酶。

2.2 4,6-二取代型2-DOS氨基糖苷抗生素的生物合成

此類抗生素的結構特征是2-DOS環(huán)的C-4和C-6位羥基被取代，以糖苷鍵與糖環(huán)相連?？敲顾?kanamycin)作為該家族的重要成員，其生物合成途徑已被清晰闡明。根據(jù)Sohng研究組和Yong研究組[58]的報道，2-DOS母核合成后，首先在糖基轉移酶KanF和去乙酰酶KacA的作用下生成巴龍霉胺，隨后通過脫氫酶KanI和轉氨酶KacL的催化生成新霉胺，這些反應與4,5-二取代型的合成相似，但此后反應差異明顯。作為合成單元，UDP-葡萄糖在脫氫酶KanC和轉氨酶KanD的作用下，轉化為UDP-卡那糖胺(UDPkanosamine)，而糖基轉移酶KanE將它連接至新霉胺的C-6位，生成卡那霉素B[58]，而Eguchi研究組的研究表明，在α-酮戊二酸依賴的非血紅素鐵氧化酶KanJ的作用下，卡那霉素B的C-2'位的氨基氧化為羰基，再由還原酶KanK加氫變?yōu)榱u基，生成卡那霉素A[59]。在此過程中，KanI、KacL和KanE具有寬泛的底物識別能力，產生了多種結構差異的中間體，其中包括了C-6'位為羥基的卡那霉素C。

另一方面，負責在2-DOS上加載N-乙酰葡萄糖胺的糖基轉移酶KanF還能以UDP-葡萄糖為底物，生成2'-去氨基-2'-羥基-巴龍霉胺(2'-deamino-2'-hydroxyparomamine)，它可作為后續(xù)一系列修飾的底物，最終轉化為C-2'位為羥基的化合物，即卡那霉素A和卡那霉素X組分。而該含有2'-去氨基-2'-羥基-巴龍霉胺的分支途徑，同樣也由于KanI、KacL和KanE的相對獨立及底物寬泛性，形成了復雜的交叉代謝網(wǎng)絡[58]。 從結構的角度來說，妥布霉素(tobramycin)屬于卡那霉素類似物，它與卡那霉素B的區(qū)別在于C-3'上的缺失了羥基，可以稱為脫氧卡那霉素B。這種單脫氧結構與另一種氨基糖苷阿泊拉霉素(也稱安普霉素,apramycin)相似，在生物合成上可能也有相似之處。

圖4 慶大霉素C生物合成途徑及其基因簇彩色標注的部分為甲基化合成步驟及其合成基因Fig.4 Gentamicin C biosynthetic pathway and its gene cluster methylation and its biosynthetic genes are highlighted in color

4,6-二取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素家族中另一重要成員是慶大霉素。它也以巴龍霉胺為合成前體，但加載第三個糖環(huán)并非葡萄糖環(huán)，而是吡喃型木糖環(huán)(圖1)。異源表達的結果顯示，它由糖基轉移酶GenM2連接至2-DOS的C-6位，形成擬三糖骨架即慶大霉素中間體A2[60](圖4)。隨后，擬三糖骨架的C-3''位的羥基經過GenD2的脫氫和GenS2的轉氨，生成DAA2，隨后甲基轉移酶GenN對其N-3''位進行甲基化修飾，生成中間體A，再由甲基轉移酶GenD1對其C-4''位進行甲基化修飾，生成中間體X2[61]，而它也是引發(fā)形成慶大霉素C多組分的重要分支點。作為一個化學結構并不十分復雜的氨基糖苷分子，慶大霉素卻存在著令人驚奇的、極其多樣的甲基化修飾，這些甲基化修飾既是慶大霉素結構多樣性和生物活性展示的重要功能基團，同時也是耐藥性產生的關鍵結構單元。除前期洪文榮等和Liu研究組發(fā)現(xiàn)的由甲基轉移酶GenK在C-6'位進行甲基化修飾生成G418[62-63]之外，孫宇輝研究組和Peter Leadlay研究組近期的研究結果揭示出甲基轉移酶GenN、GenD1和GenK的作用的先后順序并不嚴格，它們所催化的C-6'、N-3''和C-4''上的甲基化相對獨立，突破了人們對慶大霉素甲基化“串聯(lián)式”順序依次發(fā)生的傳統(tǒng)認識，首次建立了“并聯(lián)式”多步甲基化修飾的立體網(wǎng)絡模型[64](圖4)。

值得注意的是，GenD1和GenK同屬獨特的radical SAM依賴型甲基轉移酶，該家族蛋白使用[4Fe-4S]鐵硫簇和維生素B12為輔因子，可對非活性的原子甲基化，而Huang等[61-65]利用底物類似物與GenK進行體外酶學實驗，通過觀察SAM的分解和產物的生成，對其催化機理進行了更深入的探索。

在慶大霉素所有的甲基化修飾中，N-6'位甲基化對于通過代謝途徑定向阻斷來獲得依替米星(etimicin)化學半合成原料—慶大霉素C1a以及低毒性單一組分C2至關重要，但其編碼基因卻一直未曾找到，盡管慶大霉素生物合成基因簇中所有可能的甲基化基因都通過基因敲除被一一考察。最終，孫宇輝研究組和Peter Leadlay研究組[64]通過全基因組測序，并結合體外酶學和體內遺傳等手段，成功定位了負責慶大霉素生物合成最后一步甲基化基因genL。出人意料的是，該基因在染色體上與慶大霉素生物合成基因簇遠隔2.54Mb(圖4)，這一結果也為慶大霉素甲基化修飾網(wǎng)絡填補上了最后一個缺口。

慶大霉素中間體G418形成后，經過脫氫酶GenQ和轉氨酶GenB1的作用，C-2'位被氨基化，生成JI-20B[66]。陳代杰研究組和劉文研究組[67]的實驗結果表明，它經過GenP的催化，C-3'位被磷酸化形成Pi-JI-20B。根據(jù)推測，Pi-JI-20B經過3',4'-脫雙羥基，生成威達米星(verdamicin)，再經過4',5'雙鍵還原，生成慶大霉素C2a，這一系列修飾與PLP依賴的轉氨酶GenB3和GenB4有關[66]。此后C2a在差向異構酶GenB2的作用下，C-6'位立體構型改變，成為慶大霉素C2[66]。2015年，夏煥章研究組指出，GenB2也能夠催化JI-20B的C-6'位差向異構，生成epi-JI-20B。不僅如此，GenB2還可以完成JI-20B和epi-JI-20B的相互轉化[68]。如果以上各修飾過程不以G418為底物，而是以與之對應但C-6'無甲基化修飾的X2為底物，則形成了另一條與之平行的代謝途徑，被相同的酶依次催化，產生一系列C-6'位無甲基的同系物，即JI-20A(與JI-20B對應)，西索米星(與威達米星對應)，慶大霉素C1a(與C2a和C2對應)以及慶大霉素C2b(與C1對應)(圖4)。通過阻斷控制C-6'甲基化的GenK，可導致C1a和C2b所在代謝支路組分的大量積累[69-70]。但對于如何通過遺傳手段僅獲得另一代謝支路中的C2a、C2、C1各組分，仍將是一個巨大的挑戰(zhàn)。

慶大霉素B組分源于慶大霉素C生物合成途徑的另一分支，是慶大霉素產生菌的次要產物。在慶大霉素生物合成中，負責糖基加載的GenM1底物特異性較為寬泛，能以2-DOS和UDP-葡萄糖作為底物，生成卡那霉素中間體，即2'-去氨基-2'-羥基-巴龍霉胺，它可被下游的修飾酶催化，生成2'-去氨基-2'-羥基-JI-20A，即慶大霉素B[71]。此外，夏煥章研究組通過失活其染色體上負責磷酸化修飾的genP，阻斷下游的脫雙羥基和雙鍵還原等修飾，并將負責C-2'位脫氨基和羥基化的kanJ和kanK導入慶大霉素產生菌，同樣得到慶大霉素B[72]，而在喂養(yǎng)葡萄糖的情況下，過表達糖基轉移酶KanM1和GenM2則有助于提升慶大霉素B和C1a的產量[73]。

2.3 單取代型2-DOS氨基糖苷抗生素的生物合成

單取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素的特征為2-DOS母核上僅連接了一個糖環(huán)取代基。阿泊拉霉素是該家族成員的代表，其生物合成也以巴龍霉胺為前體，但根據(jù)虞沂研究組和張琪研究組的研究，其C-6'位并未被氨基化，而是通過脫水酶AprD4催化C-3'位脫水，并由NADH/NADPH依賴的還原酶AprD3還原C-4'位的羰基，生成利維胺(lividamine)[74]，該結構可能也與妥布霉素和利維霉素B等含有C-3'位單脫氧糖環(huán)結構的氨基糖苷的合成相關。在此之后，利維胺經脫氫酶AprQ催化，在C-6'位羥基脫氫[74]，但如果該步驟發(fā)生在AprD4和AprD3負責的C-3'脫氧之前，則會形成C-6'位為羰基的副產物，導致C-3'脫氧無法進行[74]。Eguchi研究組則對AprD4和AprD3的底物選擇性進行了探究，發(fā)現(xiàn)它們更傾向于C-6'為羥基而非氨基的底物[75]。 一般情況下，通過AprQ作用后，中間體經一系列催化，第二個糖環(huán)變?yōu)楹h(huán)的八碳糖環(huán)結構，隨后加載第三個糖環(huán)，并進行甲基化等后修飾[76]，形成阿泊拉霉素。值得注意的是，AprD4是radical SAM依賴的脫水酶，在反應過程中形成自由基，機理較為特殊[77]。

在單取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素中，潮霉素(hygromycin)B的生物合成也始于2-DOS。根據(jù)孫宇輝研究組的研究報道，與上述使用葡萄糖環(huán)或其衍生物為第二個結構單元的化合物不同，它是在糖基轉移酶HygF的作用下，以UDP-半乳糖為底物，將半乳糖環(huán)連接至2-DOS的C-5位[78]。而甲基轉移酶HygM可將2-DOS的N-3位甲基化，該修飾可以發(fā)生在二糖形成前或形成后，并無嚴格順序[78]。而潮霉素的第三個糖環(huán)為七碳糖，根據(jù)陳義華研究組的報道，它源自景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose-7-phosphate)。首先，異構酶HygP將它異構形成環(huán)狀的D-甘油醛-β-阿卓-庚糖(D-glycero-β-D-altro-heptose)，再通過如磷酸轉移酶HygN、磷酸酶HygU和NDP-七碳糖合酶HygO等酶催化，活化形成ADP-甘油醛-β-阿卓-庚糖，該化合物或其修飾后的產物可能是第三個糖環(huán)的直接來源[79]。潮霉素B的生物合成過程還包括氧化、轉氨和差向異構等修飾，其中尤為獨特的是第二和第三個糖環(huán)之間形成的螺環(huán)結構，這一步驟是由α-酮戊二酸依賴的非血紅素鐵氧化酶HygX實現(xiàn)的，它將羥基的氧原子與C-1''碳相連，而該反應同樣不依賴N-1位甲基化與否[78-80]。越霉素(destomycin)B是潮霉素B的類似物，它們的區(qū)別僅在于越霉素B的C-4''位立體構型與潮霉素B不同，兩者的生物合成路徑可能也非常相似。

另一個單取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素的代表為依他霉素(istamycin)A，它也以單脫氧的氨基環(huán)醇為母核，但氨基取代的位置，以及一些碳原子的立體構型與2-DOS不同。而依他霉素A的第二個糖環(huán)與慶大霉素C2b完全相同，它們在生物合成上可能存在相似之處[29]。該類型的氨基糖苷抗生素還包括dactimicin，sannamycin B和依他霉素B等，它們與依他霉素A的區(qū)別在于對母核的后修飾，dactimicin在C-6'位有甲基化修飾，與慶大霉素C1相似，sannamycin B母核的N-1位缺失了氨乙酰化修飾，而依他霉素B的C-3位立體構型發(fā)生了翻轉。

3 化學半合成氨基糖苷抗生素的替代生物合成

除天然來源的第一代氨基糖苷類抗生素外，人們亦通過化學半合成創(chuàng)造出更多結構多樣性的第二代氨基糖苷類抗生素來滿足人們對更高活性、更小副作用，特別是應對逐漸出現(xiàn)的耐藥性的需求。多種經化學半合成的氨基糖苷類抗生素已成功應用于臨床，例如通過化學方法將卡那霉素B的C-3'，C-4'羥基脫去，產生卡那霉素衍生物地貝卡星(dibekacin)[81]；通過化學方法將AHBA基團引入卡那霉素母核產生阿米卡星(amikacin)[82]；在阿米卡星的基礎之上將其C-3'和C-4'羥基脫去，產生阿貝卡星(arbekacin)[83]；將慶大霉素母核上的氨基基團利用化學方法進行烷基化修飾，產生奈替米星(netilmicin)[84]和依替米星[85]；利用類似的方法將慶大霉素B的母核上1-N引入AHBA基團產生異帕米星(isepamicin)[86](圖1)。

盡管通過化學半合成氨基糖苷類抗生素取得了長足的進展，但存在合成步驟繁瑣、產率低、環(huán)保壓力大等問題。隨著合成生物學等技術的突飛猛進，人們越來越多開始思考利用生物合成的方法來取代原本通過化學半合成獲得的氨基糖苷類抗生素，這也將成為合成下一代氨基糖苷類抗生素新的突破口。例如plazomicin是以西索米星為基本骨架，經多步化學修飾在N-1位加載AHBA側鏈，并在N-6'位進行羥乙基修飾而獲得[87]。而AHBA側鏈在丁酰苷菌素中天然存在，對于含該側鏈的半合成抗生素，可望利用合成生物學的方法，將AHBA側鏈生物合成途徑引入西索米星產生菌，運用生物發(fā)酵的方法來生產原本需要通過多步化學半合成才能獲得的plazomicin。為了實現(xiàn)這一愿景，人們已開始了探索和嘗試。如2011年，Park等[58]首次將丁酰苷菌素產生菌中負責AHBA側鏈生物合成與加載所需的7個基因btrI-btrJ-btrK-btrO-btrV-btrH-btrG與卡那霉素生物合成最小基因簇進行融合，并在委內瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)中實現(xiàn)了異源表達，在產物中檢測到含有AHBA側鏈的阿米卡星和1-N-AHBA-卡那霉素X，盡管最終轉化率不足10%，而且負責羥乙基修飾的酶在氨基糖苷類的生物合成中也尚未有報道，這也是實現(xiàn)plazomicin全生物合成需要面臨和克服的另一個挑戰(zhàn)，但這證實了利用生物合成替代化學半合成這一思路的可行性。

4 氨基糖苷生物合成酶的結構研究

分子遺傳學、生物化學及化學生物學方法的應用，大大推動了氨基糖苷抗生素的生物合成研究，而結構生物學的進展，則從更深層次的角度揭示了相關酶的微觀特征及其催化機制。Eguchi研究組[88]于2007年解析了丁酰苷菌素生物合成中負責2-DOS母核結構合成的第一個酶，即NAD+/NADP+依賴的2-DOI合酶BtrC的晶體結構，它為非對稱二聚體，且具有兩個不同的活性位點，并與Co2+結合，該研究闡明了BtrC的催化機理。

在氨基糖苷的生物合成中，涉及到很多PLP依賴的酶。Spencer研究組[89]揭示了在丁酰苷菌素2-DOS生物合成中負責兩步轉氨反應的BtrR，確定其屬于天冬氨酸轉氨酶類，獲得了它與輔因子PLP/PMP(pyridoxamine phosphate,PMP)結合后的晶體結構，通過分析其結構差異，推測了對底物識別的影響。他們還研究了同為PLP依賴酶的BtrK，它在AHBA側鏈的合成中執(zhí)行脫羧功能，在其遞交的結構數(shù)據(jù)中可見酶與PLP結合的活性中心。而Holden研究組[90]則通過對該蛋白與來自于核糖霉素生物合成途徑的同源蛋白RbmB的結構對比，分析了兩者在結合2-DOS底物后的外亞胺狀態(tài)下的空間結構的異同。該研究組還通過X-射線晶體衍射技術，獲得了新霉素合成中PLP依賴的轉氨酶NeoB的結構信息。該酶能催化C-6'和C-6'兩個位點的轉氨，而該研究揭示了它與不同底物結合的狀態(tài)和活性位點，并與慶大霉素生物合成中的C-6'轉氨酶GenB1進行了對比[91]。2019年，Ban等[71]對GenB1的結構經歷了進行了更細致的考察，揭示了其中的甲基口袋對于底物識別和結合效率的影響。

對于慶大霉素生物合成中的關鍵酶，Dias研究組[92]解析了其中甲基轉移酶GenN的晶體結構，確證了它對多種底物的甲基化活性，并通過對其三維結構的分析，闡釋了這種底物寬泛性的來源。該研究組還解析了慶大霉素合成中另一個關鍵酶GenD2的結構信息，GenD2是NAD+/NADP+依賴的氧化還原酶，負責C-3''羥基的脫氫，通過結構分析確認了其中兩處特殊的β-折疊，并分析了它對二聚體形成及底物識別的影響[93]。

McCulloch等[80]推測HygX為氧化酶，可能負責潮霉素B生物合成中最后一步成環(huán)反應，并獲取了它與潮霉素B的共結晶，雖然該結果中以鎳離子代替了實際發(fā)揮作用的鐵離子，并測定了它與潮霉素B的底物親和性。作者據(jù)此推測了HygX的催化氧化環(huán)化反應的機理，并比較了它與其它α-酮戊二酸依賴的非血紅素鐵氧化酶在結構上的異同。

近年來，radical SAM依賴酶在天然產物中的作用逐步成為研究的難點和熱點，該家族蛋白往往對氧極為敏感，且在體外往往需要進行鐵硫簇重組才具有活性，對實驗條件要求較高，這可能是其早期研究并不充分的原因之一。2007年，Eguchi研究組[42]解析了丁酰苷菌素生物合成途徑中脫氫酶BtrN與底物與SAM的共結晶，其折疊方式與已知模型有明顯差異。研究結果還顯示，除了催化SAM裂解的鐵硫簇之外，該酶還結合了一個輔助鐵硫簇，而根據(jù)它與底物的相對位置分析及與同類蛋白的對比，它可能與氧化還原的催化過程緊密相關。Nicolet研究組和張琪研究組測定了阿泊拉霉素生物合成途徑中脫水酶AprD4的結構，結果顯示它僅有一個鐵硫簇，通過對底物共結晶的分析，指出了底物構象對于催化的影響，并闡明了與該反應配套的質子傳遞鏈[77]。

5 總結與展望

綜上所述，來自分子遺傳學、生物化學和結構生物學的國內外研究進展使氨基糖苷類抗生素生物合成途徑和機制正逐漸清晰，這不僅有助于徹底解答困擾已久的重要基礎科學問題，也為人們利用合成生物學方法進行定向優(yōu)化和理性創(chuàng)制第三代新型氨基糖苷類抗生素提供了必要前提。但截至目前，仍有一些關鍵的生物合成機制問題還有待揭示，如作為氨基糖苷類抗生素經典代表的慶大霉素，目前關于其絳紅糖胺(purpurosamine)結構上3',4'-脫雙羥基和4',5'-雙鍵還原機制依然是一個未解之謎，它不僅直接關乎慶大霉素重要代謝中間產物西索米星的生物合成，更是慶大霉素完整生物合成線路圖中不可或缺的最后一塊神秘“拼圖”。再如阿泊拉霉素中八碳糖結構單元的合成和并環(huán)過程、潮霉素B中C-2'位的差向異構，以及福提霉素和依他霉素的母核合成路徑等問題。另外，目前仍有許多功能已知但結構未知的蛋白，尤其是radical SAM依賴的酶，其生成自由基的獨特機理以及對非活潑碳原子的修飾機制備受關注。目前已獲得的蛋白結構數(shù)據(jù)有限，多是基于X-射線晶體衍射技術，但該技術對蛋白晶體的質量要求較高，而新興的冷凍電鏡技術或許有助于難以獲得結晶的蛋白的結構解析?？梢灶A見，隨著結構生物學技術的發(fā)展，氨基糖苷類抗生素生物合成途徑中更多蛋白的結構和功能將被揭示，從而加深人們對這一種重要類別抗生素生物合成機理的認知和利用。