袁耀佐 張玫 金少鴻

(1 國(guó)家藥監(jiān)局化學(xué)藥品雜質(zhì)譜研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210019；2 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019；3 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

1 氨基糖苷類抗生素概述

氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside antibiotics)是臨床使用較早的一類抗生素，其與β-內(nèi)酰胺類藥物聯(lián)合使用時(shí)有良好的協(xié)同作用，用藥方便，價(jià)格低廉，有臨床應(yīng)用價(jià)值的品種達(dá)200余種，但部分品種臨床不良反應(yīng)特別是耳腎毒性嚴(yán)重限制了使用，目前臨床常用的品種僅20種左右，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖1～3)、來(lái)源、分類、原研公司等基本信息在相關(guān)文獻(xiàn)中已有系統(tǒng)總結(jié)[1]。文獻(xiàn)[2]按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、抗菌譜和耐鈍化酶等，將氨基糖苷類抗生素類抗生素發(fā)展分為3個(gè)階段，或稱為3代：第1代以卡那霉素為代表，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是完全羥基化的氨基糖與氨基環(huán)醇相結(jié)合，不抗銅綠假單胞菌；第2代以慶大霉素為代表，其結(jié)構(gòu)中均含有脫氧氨基糖，具有抗銅綠假單胞菌的特點(diǎn)；第3代則是氨基環(huán)醇上1-N位取代的半合成衍生物，代表性品種有阿米卡星、奈替米星、依替米星、異帕米星等，其特點(diǎn)是保留了母體的抗菌活性，耳腎毒性較母核小，并對(duì)耐藥菌的鈍化酶有良好的抵御作用，其中依替米星為我國(guó)自主研發(fā)的一類新藥；2018年由Achaogen開(kāi)發(fā)并獲美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的新型氨基糖苷類抗生素普拉佐米星(plazomicin)，可治療多重耐藥性的腸桿菌科菌引起的嚴(yán)重感染?？上У氖?，由于“監(jiān)管方面的不利因素以及唯一的抗生素品種市場(chǎng)非常有限，抗生素企業(yè)市場(chǎng)環(huán)境艱難、資金來(lái)源不斷減少”等原因，Achaogen于2019年4月申請(qǐng)破產(chǎn)[3]，但此新型氨基糖苷類抗生素普拉佐米星(500mg/10mL)已被WHO基本藥物目錄第21版(2019)收入。氨基糖苷類抗生素的歷史變遷如圖4所示。

圖1 常見(jiàn)的4,6雙取代脫氧鏈霉胺的氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of deoxystreptamine aminoglycosides,4,6-disubstituted

圖2 常見(jiàn)的4,5雙取代脫氧鏈霉胺的氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of deoxystreptamine aminoglycosides,4,5-disubstituted

圖3 藥典中收載過(guò)的其它氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of some other aminoglycosides antibiotics incorporated in pharmacopeia (s)

2 氨基糖苷類抗生素國(guó)內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀

圖4 氨基糖苷類抗生素變遷過(guò)程示意圖Fig.4 Evolution paths of aminoglycosides antibiotics

目前全球藥典約50余種[4]，作為一類重要的抗生素，氨基糖苷類抗生素原料及其制劑在國(guó)內(nèi)外主要藥典均有收載，但各藥典收載的品種、劑型不盡相同，設(shè)置的控制項(xiàng)目、測(cè)定方法及限度也不完全一致，為協(xié)調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)，1990年ICH率先成立藥典討論工作組(Pharmacopeia Discussion Group,PDG)，并成立專家工作組(Expert Working Group,EWG)，試圖在ICH成員國(guó)之間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)。2012年，WHO通過(guò)溝通、合作、協(xié)作和組建聯(lián)盟等手段，也在積極尋求藥典標(biāo)準(zhǔn)的一致性，但迄今為止，效果甚微。為了方便讀者了解氨基糖類抗生素國(guó)內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀，特將中國(guó)藥典2015年版(ChP2015)、美國(guó)藥典42版-處方集37版(USP42-NF37)、英國(guó)藥典2019(BP2019)、韓國(guó)藥典第10版(KPX)、印度藥典2010年版(IP2010)、國(guó)際藥典第8版(Ph.Int.8th)中氨基糖苷類抗生素的原料及制劑的收載情況進(jìn)行歸納總結(jié)，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行評(píng)述。

2.1 藥典收載情況

氨基糖苷類抗生素原料及其制劑在國(guó)內(nèi)外主要藥典均有收載，各國(guó)藥典的收載情況如表1所示，原料共涉及16個(gè)品種，ChP2015收載最多，為14種。日本藥典從第15版開(kāi)始不再收載硫酸阿司米星，USP42-NF37、JP17等也不再收載硫酸西索米星及硫酸奈替米星的原料及制劑。

藥典涉及劑型有注射液、注射用、片劑、緩釋片、膠囊劑、軟膏、眼用軟膏、子宮輸液(uterine infusion)、眼用溶液、口服溶液、注射用混懸液(injectable suspension)、滴耳液、霧化用溶液(nebulizer solution)、吸入液(inhalation solution)等，美國(guó)藥典收載的劑型最為全面。氨基糖苷類抗生素主要以注射液、注射用以及外用制劑為主，也有用于腸道疾病治療的口服劑型。藥典中還有很多復(fù)方制劑，如USP42-NF37中新霉素的復(fù)方制劑就達(dá)53種之多。

2.2 藥典標(biāo)準(zhǔn)分析與評(píng)述

國(guó)內(nèi)外主要藥典中氨基糖苷類抗生素原料藥標(biāo)準(zhǔn)正文部分主要涉及如下14個(gè)項(xiàng)目：分子式(chemical formula)、化學(xué)名稱(chemical name)、定義(definition)、生產(chǎn)工藝(manufacture/production)、性狀(characters)、鑒別(identification/identities test)、檢查(tests)、含量測(cè)定(assay)、類別(categories)、包裝與貯藏(container and storage)、制劑(formulation)、雜質(zhì)列表(impurities)、標(biāo)簽(labeling)、補(bǔ)充要求或信息(additional requirements/additional information)。不同品種的氨基糖類抗生素藥典標(biāo)準(zhǔn)收載的主要項(xiàng)目基本一致，但因監(jiān)管體系、體例要求、思維方式乃至習(xí)慣沿襲等不同，也出現(xiàn)部分收載項(xiàng)目及具體要求有較大的差異。在藥典標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有些項(xiàng)目執(zhí)行過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)分歧，本部分主要針對(duì)需要關(guān)注或者容易出現(xiàn)爭(zhēng)議的項(xiàng)目進(jìn)行討論。至于制劑方面，由于劑型種類較多，考慮篇幅，本文不進(jìn)行具體介紹。

表1 氨基糖苷類抗生素原料在國(guó)內(nèi)外主要藥典的收載情況Tab.1 List of pharmaceutical substance of aminoglycosides adopted in the main pharmacopeias

2.2.1 性狀

性狀項(xiàng)在大多數(shù)藥典中為強(qiáng)制執(zhí)行項(xiàng)目，一般包含顏色、狀態(tài)、臭味、引濕性等，中國(guó)藥典通常還會(huì)將溶劑中的溶解度、比旋度等物理參數(shù)列在性狀項(xiàng)中。該項(xiàng)目執(zhí)行過(guò)程會(huì)出現(xiàn)很多問(wèn)題，如(1)臭味需要實(shí)驗(yàn)者去聞和嘗，對(duì)檢驗(yàn)者健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)；(2)形狀和顏色因?yàn)橹饔^判斷，容易出現(xiàn)爭(zhēng)議；(3)溶解度也會(huì)因工藝不同出現(xiàn)偏差等。為此，USP中性狀項(xiàng)已經(jīng)不再列入正文，而是在Reagents and reference table中以“Description and relative solubility”形式出現(xiàn)，只作為參考信息，不作為強(qiáng)制執(zhí)行項(xiàng)目。另外需要提醒的一點(diǎn)還有“引濕性”，以往藥典描述比較籠統(tǒng)，各國(guó)藥典均沒(méi)有一個(gè)具體的測(cè)定方法，中國(guó)藥典從2015年版開(kāi)始，制定了“9103藥物引濕性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”，規(guī)定了具體的測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)。中國(guó)藥典注意到上述問(wèn)題，正在著手修訂相關(guān)內(nèi)容，如中國(guó)藥典四部中部分品種已經(jīng)將容易出現(xiàn)爭(zhēng)議的性狀內(nèi)容刪除，部分有重要信息提示的內(nèi)容也是以“注”的形式體現(xiàn)。

2.2.2 鑒別

目前常見(jiàn)氨基糖苷類抗生素藥典方法如表2所示。表中顯示，由于絕大部分氨基糖苷類抗生素?zé)o紫外特征吸收，目前常規(guī)的儀器分析方法如UV，HPLC-UV均不適用；通常情況下，紅外分光光度法(IR)因其譜圖能很好地反映特征官能團(tuán)而具有較佳的專屬性，但對(duì)于氨基糖苷類抗生素，由于大多數(shù)特征基團(tuán)均為氨基和羥基，IR對(duì)該類產(chǎn)品的區(qū)分力不強(qiáng)，因此，有采用化學(xué)顯色和薄層色譜(TLC)進(jìn)行補(bǔ)充，中國(guó)藥典及歐洲藥典中則采用了專屬性較佳HPLC方法；在歐洲藥典9.0(Ph.Eur9.0)和日本藥局方17版(JP17)的妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)中，還將核磁共振氫譜應(yīng)用于鑒別。在歐美藥典中，還會(huì)采用熔點(diǎn)、比旋度等理化特征作為鑒別項(xiàng)目，如硫酸卡那霉素在Ph.Eur.9.0中把熔點(diǎn)作為鑒別的方法之一。

2.2.3 檢查

國(guó)內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)分析結(jié)果顯示，氨基糖苷類抗生素原料藥檢查包含“比旋度、酸度、溶液的澄清度與顏色、硫酸鹽、有關(guān)物質(zhì)/特定雜質(zhì)、殘留溶劑、干燥失重/水分、重金屬、組分組成、可見(jiàn)異物、不溶性微粒、異常毒性、細(xì)菌內(nèi)毒素/熱源、降壓物質(zhì)、無(wú)菌、結(jié)晶性、抽針試驗(yàn)”等17個(gè)項(xiàng)目，限于篇幅，本文主要就藥典標(biāo)準(zhǔn)中方法、限度等有較大差異的項(xiàng)目進(jìn)行分析。

表2 主要藥典中氨基糖苷類抗生素鑒別方法一覽表Tab.2 List of the identification methods of aminoglycosides antibiotics in some pharmacopoeias

(1)比旋度：比旋度可以反映產(chǎn)品的純度，如硫酸新霉素為新霉素B和新霉素C混合物(Ph.Eur.9.0要求新霉素C不小于15.0%)，其比旋度要求在“+53.5～+59.0”；而高純度的新霉素B(福萊霉素，framycetin sulfate，要求新霉素C不得過(guò)3.0%)，其比旋度要求在“+52.5～+55.5”；有時(shí)還可以作為鑒別項(xiàng)的一部分，如JP17中硫酸卡那霉素(以卡那霉素A為主，卡那霉素B不得過(guò)4%)的比旋度要求在“+103～+115”，而硫酸卡那霉素B(bekanamycin sulfate，純度不低于97%)比旋度要求為“+102～+116”。

(2)硫酸鹽與酸堿度：現(xiàn)有藥典收載的原料中，除鹽酸大觀霉素外，其余均為硫酸鹽，氨基糖苷類抗生素分子中含有多個(gè)氨基，其可結(jié)合具體數(shù)目的硫酸根，如2分子依替米星結(jié)合5分子硫酸根；但對(duì)于發(fā)酵來(lái)源的氨基糖苷類抗生素，有些硫酸根數(shù)目不明確，如硫酸卡那霉素；還有些品種可能會(huì)出現(xiàn)不同硫酸鹽結(jié)合率的多個(gè)產(chǎn)品，如阿米卡星有結(jié)合1.8分子和2分子的硫酸根的產(chǎn)品，因此，標(biāo)準(zhǔn)中需要控制硫酸鹽的含量。傳統(tǒng)的測(cè)定硫酸鹽含量的方法采用絡(luò)合滴定法，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)滴定突躍往往不明顯，很難判斷終點(diǎn)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果誤差大。中國(guó)藥典采用HPLC-ELSD法測(cè)定氨基糖苷類抗生素中硫酸鹽含量，還有不少文獻(xiàn)報(bào)道采用離子色譜法測(cè)定硫酸鹽的含量[5]，從誤差的角度分析，離子色譜方法比較準(zhǔn)確，但其檢驗(yàn)成本相對(duì)較高，因此，在實(shí)際工作中，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行方法選擇。

還有研究顯示，組分單一的氨基糖苷類抗生素如核糖霉素，其硫酸鹽含量與其特定溶液的pH之間呈明顯的負(fù)相關(guān)[6]，但是對(duì)于多組分氨基糖苷類抗生素如硫酸慶大霉素和硫酸新霉素，中國(guó)藥典與歐美藥典中硫酸鹽限度要求一致，但pH值的限度有所差別，導(dǎo)致上述差異的可能原因是由于國(guó)內(nèi)外菌種來(lái)源、發(fā)酵工藝等差異導(dǎo)致組分分布的差別。因此，在質(zhì)量與療效一致性評(píng)價(jià)過(guò)程中，不能簡(jiǎn)單比較藥典的異同，而是需要通過(guò)物質(zhì)基礎(chǔ)分析來(lái)探討導(dǎo)致上述差異的內(nèi)在原因。另外，硫酸鹽的含量還與主成分的效價(jià)或含量直接相關(guān)。

(3)溶液的顏色與澄清度：氨基糖苷類抗生素的原料藥藥典標(biāo)準(zhǔn)中，幾乎全部有溶液的顏色與澄清度檢查項(xiàng)，該項(xiàng)目是控制質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，其對(duì)有關(guān)物質(zhì)等雜質(zhì)控制的重要補(bǔ)充。其中，溶液的顏色是用于控制有色雜質(zhì)，而澄清度則是控制不溶性雜質(zhì)。

溶液的顏色測(cè)定方法主要有目視比色法、紫外分光光度法及色差計(jì)法3種，但對(duì)比發(fā)現(xiàn)，中國(guó)藥典和歐美日藥典在該檢測(cè)項(xiàng)有較大不同。而對(duì)于同一品種，國(guó)內(nèi)外對(duì)該項(xiàng)目的要求差異還很大，以硫酸慶大霉素為例，中國(guó)藥典要求“溶液應(yīng)澄清無(wú)色，如顯色如顯渾濁，與1號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色或黃綠色2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，均不得更深”。而歐洲藥典規(guī)定“溶液應(yīng)澄清無(wú)色；如顯色，與合適顏色的6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，均不得更深”。從字面看，二者差異很大，尤其在顏色的要求方面，但對(duì)藥典相關(guān)通則研讀發(fā)現(xiàn)，中國(guó)藥典與歐美藥典的標(biāo)準(zhǔn)色系完全不同(如中國(guó)藥典規(guī)定幾乎無(wú)色為供試品溶液顏色不深于相應(yīng)色調(diào)0.5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比色液，歐洲藥典則規(guī)定不深于相應(yīng)色調(diào)的9號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比色液)，周怡[7]在其研究論文“溶液顏色檢查方法”判定標(biāo)準(zhǔn)色系模型的建立與應(yīng)用”中詳細(xì)介紹了進(jìn)行溶液顏色檢查的原因，分析了方法間的差異，最后利用色差計(jì)法，建立溶液顏色色系模型分析中、歐藥典各色系在模型中所處位置，確定利用色系模型進(jìn)行溶液顏色判定的方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有結(jié)果判定方法不能統(tǒng)一的不足，為進(jìn)行溶液顏色檢查提供了新的思路。根據(jù)檢驗(yàn)的原理，比較現(xiàn)有溶液顏色檢查的3種方法，說(shuō)明利用色差計(jì)進(jìn)行檢驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)。上述研究闡明了目前在該項(xiàng)目國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)差異的原因所在，為協(xié)調(diào)解決國(guó)內(nèi)外藥典規(guī)定的差異提供理論和實(shí)踐方面的支持。

(4)有關(guān)物質(zhì)：有關(guān)物質(zhì)是控制產(chǎn)品質(zhì)量一致性的關(guān)鍵指標(biāo)，而色譜技術(shù)是控制有關(guān)物質(zhì)和組分的最有效手段，色譜技術(shù)的發(fā)展直接反映在有關(guān)物質(zhì)控制水平上。但對(duì)于氨基糖苷類抗生素，由于其為強(qiáng)極性物質(zhì)，在常用的反相色譜體系下保留很弱，而且絕大多數(shù)氨基糖苷類抗生素?zé)o特征紫外吸收基團(tuán)，無(wú)法應(yīng)用常規(guī)的紫外方法進(jìn)行檢測(cè)，這些都給該類產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)和組分測(cè)定帶來(lái)挑戰(zhàn)。但是，近年來(lái)，隨著色譜分離及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，多種分離及檢測(cè)技術(shù)均得到運(yùn)用，相關(guān)的研究進(jìn)展已經(jīng)有綜述報(bào)道[1,8]，但有些研究進(jìn)展并沒(méi)有及時(shí)體現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)中，藥典中方法控制現(xiàn)狀如表3。中國(guó)藥典收載的14個(gè)氨基糖苷類抗生素，有11個(gè)品種的有關(guān)物質(zhì)均采用HPLC-ELSD法進(jìn)行控制，由于與ELSD檢測(cè)器相兼容的流動(dòng)相需要揮發(fā)性，這限制了流動(dòng)相優(yōu)化的空間，使得現(xiàn)有藥典的色譜條件分離能力有限，部分品種的主峰中還會(huì)包裹相鄰雜質(zhì)，為此，中國(guó)藥典借鑒歐美藥典的做法，引入脈沖安培電化學(xué)檢測(cè)器，并在2015年版依替米星標(biāo)準(zhǔn)中首載HPLC-PAD的四波形電位法用于有關(guān)物質(zhì)和和含量測(cè)定，改善了原有標(biāo)準(zhǔn)的分離能力和檢測(cè)靈敏度，四波形電位的應(yīng)用還較大的改善了歐美藥典普遍采用的三電位波形的耐用性[9]；針對(duì)某些現(xiàn)有色譜流動(dòng)相所有試劑昂貴等問(wèn)題(如配制現(xiàn)有中國(guó)藥典中核糖霉素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用流動(dòng)相1升，成本接近3000元人民幣)，袁耀佐等[10-13]對(duì)該方法進(jìn)行條件優(yōu)化，在保證實(shí)驗(yàn)效果更優(yōu)的前提下，檢驗(yàn)成本直降97%。表3顯示，歐洲藥典更愿意采用HPLC-PAD法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的控制，但由于歷史原因，他們標(biāo)準(zhǔn)中PAD的電位參數(shù)設(shè)置均為三電位波形，該波形下金電極表面容易損耗，影響方法的耐用性，在流動(dòng)相組成方面，歐洲藥典相關(guān)流動(dòng)相中鹽的濃度也較高，并主要使用烷基磺酸鈉類離子對(duì)試劑增加色譜保留，對(duì)色譜儀器、色譜柱尤其是電極的耐用性影響較大，方法的重現(xiàn)性也較差，歐洲藥典在執(zhí)行過(guò)程也意識(shí)到這點(diǎn)，因此對(duì)慶大霉素有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用與中國(guó)藥典類似的三氟乙酸體系的流動(dòng)相，實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)該流動(dòng)相體系比原來(lái)的高鹽及烷基磺酸鈉流動(dòng)相體系穩(wěn)定?？紤]到特殊檢測(cè)器的特殊要求，中國(guó)藥典利用末端紫外吸收檢測(cè)阿米卡星的有關(guān)物質(zhì)，但在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)效果并不理想。而日本藥典則采用柱后衍生熒光檢測(cè)法測(cè)定異帕米星的有關(guān)物質(zhì)，張楊慧等[14]還將該方法推廣至新霉素的有關(guān)物質(zhì)檢查，發(fā)現(xiàn)效果良好。近年來(lái)還有采用LC-CAD[12]及LC-NAQD法[15]檢測(cè)相應(yīng)的氨基糖苷類抗生素的有關(guān)物質(zhì)。但其應(yīng)用于藥典的可行性還需要驗(yàn)證。

表3 主要藥典中氨基糖苷類抗生素有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法一覽表Tab.3 List of the methods of related substances of aminoglycosides antibiotics in some pharmacopoeias

(5)組分組成：目前所有藥典均將硫酸慶大霉素作為以慶大霉素C組分為主的多組分抗生素，中國(guó)藥典和美國(guó)藥典也將硫酸新霉素作為含有新霉素B和新霉素C的雙組分抗生素，但歐洲藥典將新霉素C作為有關(guān)物質(zhì)；中國(guó)藥典及美國(guó)藥典中將巴龍霉素作為含有巴龍霉素I和II的雙組分；歐洲藥典還將鹽酸大觀霉中的雙氫大觀霉素作為有效成分，藥典收載的其他品種均為單一組分。

由于生產(chǎn)工藝、臨床研究及使用的情況不同，各藥典對(duì)組分之間比例的規(guī)定也不盡相同，如硫酸慶大霉素在不同藥典中慶大霉素C組分的比例要求見(jiàn)表4。這些要求之間的協(xié)調(diào)比較困難，這給該產(chǎn)品的進(jìn)出口之間帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)，目前李繼安等[16]發(fā)明了慶大霉素聯(lián)產(chǎn)工藝很好地解決這一難題。

目前主流藥典對(duì)氨基糖苷類抗生素組分之間的比例計(jì)算主要是面積歸一化方法，該方法有時(shí)無(wú)法反映各組分在原料中真實(shí)含量，中國(guó)藥典2015版采用外標(biāo)法測(cè)定慶大霉素C組分的含量，再依據(jù)含量計(jì)算各自的比例，并且規(guī)定按外標(biāo)法計(jì)算，4個(gè)組分的含量和應(yīng)不少于50%，該方法在一定程度上推動(dòng)了國(guó)產(chǎn)慶大霉素質(zhì)量的提高[17-19]。

(6)干燥失重/水分：氨基糖苷類抗生素除鹽酸大觀霉素中含有結(jié)晶水外，其余藥典收載的品種中均無(wú)結(jié)晶水的描述。本類抗生素均為引濕性，不同品種含有的吸附水差異較大，因此藥典要求也不同，如硫酸慶大霉素美日韓藥典要求干燥失重不得過(guò)18.0%；而硫酸卡那霉素則規(guī)定干燥失重不得過(guò)4.0%或5.0%。對(duì)于測(cè)定方法，目前主要有兩種方法，即干燥失重法和卡爾費(fèi)休氏法。干燥失重法還分為常壓法和減壓法，不同藥典關(guān)于干燥失重的終點(diǎn)判斷也不完全一致；而卡爾費(fèi)休氏法中所用溶劑主要有甲醇、不同比例的甲酰胺-甲醇/乙二醇-甲醇。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，干燥失重法如采用中國(guó)藥典常用的干燥至恒重作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，絕大多數(shù)品種需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到，考慮到本品含水量均較大，從不確定度的角度來(lái)評(píng)價(jià)，恒重與否帶來(lái)的誤差幾乎可以忽略，綜合平衡檢驗(yàn)成本與結(jié)果準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)，采用特定條件下干燥一定的時(shí)間(如3h或24h)進(jìn)行測(cè)定比較科學(xué)經(jīng)濟(jì)。但在進(jìn)行方法的選擇確定時(shí)應(yīng)進(jìn)行科學(xué)的評(píng)估?？紤]到卡爾費(fèi)休氏法測(cè)定的便捷快速，在方法開(kāi)發(fā)時(shí)用其替代干燥失重方法是自然的想法，國(guó)內(nèi)外藥典中也有部分品種采用該方法，但是氨基糖苷類抗生素在常用的無(wú)水甲醇中溶解性較差，會(huì)因終點(diǎn)很難達(dá)到導(dǎo)致測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，并且往往測(cè)定結(jié)果重復(fù)性欠佳。為此，部分品種采用不同比例的甲酰胺-甲醇/乙二醇-甲醇的混合溶液替代無(wú)水甲醇作為測(cè)定溶劑，在一定程度上改善上述不足，但實(shí)際效果往往也不夠理想。

(7)重金屬：氨基糖苷類抗生素藥典標(biāo)準(zhǔn)正文中，不少品種的規(guī)定重金屬檢查項(xiàng)目，測(cè)定方法也主要以目視比色法為主。但近年來(lái)，隨著元素雜質(zhì)分析技術(shù)的發(fā)展，ICH率先提出對(duì)重金屬等元素雜質(zhì)的精細(xì)化控制，即ICH Q3D，后來(lái)美國(guó)藥典會(huì)從USP41版開(kāi)始，在原料正文中刪除對(duì)重金屬的具體要求，但在通則＜232＞、＜233＞中規(guī)定了所有成品中元素雜質(zhì)的要求。因此，制劑企業(yè)在選擇生產(chǎn)制劑用原輔料時(shí)，就必須對(duì)他們中的重金屬含量進(jìn)行評(píng)估，也就是說(shuō)，雖然藥典正文中取消了對(duì)重金屬的具體要求，并不等于對(duì)重金屬?zèng)]有要求，相反，有時(shí)候在企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)相關(guān)元素的要求反而更嚴(yán)，這個(gè)需要注意。

表4 慶大霉素C組分在主要藥典中的限度要求Tab.4 The specification setting of gentamicin C components in gentamicin sulfate in some pharmacopoeias.

2.2.4 含量測(cè)定

國(guó)內(nèi)外主要藥典中氨基糖苷類抗生素含量測(cè)定方法如表5所示，絕大多數(shù)品種仍采用微生物檢定法控制含量，該方法為經(jīng)典方法，其優(yōu)勢(shì)在于測(cè)定結(jié)果在一定程度上可以直接反應(yīng)抗生素的抗菌活性，但是其也存在操作繁瑣、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)等不足。因此，很多企業(yè)在生產(chǎn)實(shí)際質(zhì)量控制過(guò)程中，采用儀器測(cè)定方法替代微生物檢定方法，美國(guó)藥典于1994年在藥典論壇(PF)中就發(fā)表了題為“Use of liquid chromatography for the assay of antibiotics.Stimuli to the revision process”的文章，供大家討論采用儀器方法替代微生物檢定法的測(cè)定效價(jià)的可行性及替代方法驗(yàn)證的內(nèi)容等，經(jīng)過(guò)多年的積累，最后于USP38-NF33-S2推出“＜1223.1＞VALIDATION OF ALTERNATIVE METHODS TO ANTIBIOTIC MICROBIAL ASSAYS”。后來(lái)，WHO也于2017年推出類似的討論稿。中國(guó)藥典盡管在通則方面落后于上述藥典，但在各論方法的研究方面處于國(guó)際領(lǐng)先，常艷等[20-23]在這方面有較為系統(tǒng)的研究，并已經(jīng)成功地建立兩性霉素B[20]、硫酸慶大霉素[21]、萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素[22]、替考拉寧[23]等HPLC替代微生物檢定法測(cè)定效價(jià)的方法，其中兩性霉素B的方法已經(jīng)被中國(guó)藥典2015年版所收載。

目前，國(guó)內(nèi)外藥典在含量測(cè)定方法選擇的思路差異較大，以HPLC方法為例，有采用UV(利用紫外末端吸收)和ELSD/PAD方法直接檢測(cè)，有利用柱前衍生紫外檢測(cè)，也有利用柱后衍生法等，而鹽酸大觀霉素，USP和國(guó)際藥典仍采用衍生化的GC-FID方法。鑒于上述現(xiàn)狀，國(guó)家藥典委于2019年特設(shè)立研究課題“氨基糖苷類抗生素的含量和有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的優(yōu)化與應(yīng)用”，其中任務(wù)之一就是開(kāi)展氨基糖苷類抗生素含量測(cè)定方法的現(xiàn)代化。該課題的另一任務(wù)就是希望建立更經(jīng)濟(jì)適用的檢驗(yàn)方法。實(shí)際檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有藥典中部分方法檢驗(yàn)成本較高，如配制中國(guó)藥典中硫酸核糖霉素的含量測(cè)定用流動(dòng)相1L約需3000元人民幣；同樣，USP41中配制奈替米星含量測(cè)定方法的流動(dòng)相1升也約需500元人民幣。為此，很多學(xué)者開(kāi)展色譜條件的優(yōu)化工作，如史孫亮等[24]建立的核糖霉素測(cè)定用流動(dòng)相成本僅為藥典方法的3%，趙述強(qiáng)等[25]經(jīng)過(guò)優(yōu)化建立的奈替米星含量測(cè)定用色譜流動(dòng)相成本也僅為USP流動(dòng)相的四分之一。

表5 主要藥典中氨基糖苷類抗生素含量測(cè)定方法一覽表Tab.5 List of the methods of assay of aminoglycosides antibiotics in some pharmacopoeias.

3 氨基糖苷類抗生素雜質(zhì)譜研究中遇到的挑戰(zhàn)與對(duì)策

3.1 法規(guī)/指南的進(jìn)展

對(duì)藥物雜質(zhì)譜的控制是保證藥品用藥安全的重要環(huán)節(jié)，仿制藥一致性評(píng)價(jià)研究過(guò)程中，雜質(zhì)譜的研究更是與原研制劑質(zhì)量比對(duì)的重要指標(biāo)。目前上市的氨基糖苷類抗生素均為發(fā)酵及半合成來(lái)源，與化學(xué)合成工藝相比，發(fā)酵工藝更具多變性，不易控制，因此與單純使用化學(xué)合成生產(chǎn)的產(chǎn)品相比，生產(chǎn)工藝含有發(fā)酵步驟的活性物質(zhì)的雜質(zhì)分布一般比較復(fù)雜和難以預(yù)測(cè)，ICH Q3指南不適合用于此類產(chǎn)品的雜質(zhì)譜研究。2012年6月，EMA(European Medicines Agency)正式發(fā)布了抗生素有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制訂指導(dǎo)原則[26]，這也是國(guó)際上首個(gè)針對(duì)抗生素雜質(zhì)研究制訂的指導(dǎo)原則。該指南旨在為不適用于 ICH Q3指南的發(fā)酵產(chǎn)品或源于發(fā)酵產(chǎn)品的半合成物質(zhì)中雜質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定提供指導(dǎo)，對(duì)于活性成分為發(fā)酵或半合成來(lái)源的抗生素制劑產(chǎn)品的相關(guān)雜質(zhì)。該指南給出了報(bào)告、鑒定和界定閾值，在活性物質(zhì)由多個(gè)密切相關(guān)的化合物混合組成(family)情況下，對(duì)其應(yīng)用一般的閾值存在困難。針對(duì)此，該指南就如何設(shè)定閾值和如何論證雜質(zhì)譜給出了具體指導(dǎo)(表6)，但同時(shí)特別強(qiáng)調(diào)，該指南不可回顧性使用，即不適用于已完成注冊(cè)上市銷(xiāo)售的產(chǎn)品，但可作為歐洲藥典專論修訂的重要參考。

3.2 分離檢測(cè)

氨基糖類抗生素在常規(guī)反相色譜柱中不保留，為了增加色譜保留，應(yīng)在流動(dòng)相中添加離子對(duì)試劑，目前國(guó)內(nèi)外藥典中常用的離子對(duì)試劑主要采用多氟酸及烷基磺酸鈉兩類。近年來(lái)，LC-MS是目前快速推定檢出雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的最有效手段，對(duì)于上述兩類流動(dòng)相，因高濃度的多氟酸嚴(yán)重抑制質(zhì)譜離子化信號(hào)以及烷基磺酸鈉無(wú)法揮發(fā)等因素，無(wú)法將現(xiàn)有的藥典色譜條件直接應(yīng)用于LC-MS，限制了對(duì)藥典色譜條件下檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定。

可能由于受當(dāng)時(shí)技術(shù)的限制，早期文獻(xiàn)更多關(guān)注的是雜質(zhì)的檢出以及對(duì)檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定，LC-MS的色譜條件包括以下幾類，(1)采用低濃度的多氟酸流動(dòng)相[27]；(2)在多氟酸流動(dòng)相中添加醋酸銨[28]；(3)采用高pH值的氨水-醋酸流動(dòng)相[29-31]，(4)通過(guò)衍生化增加氨基糖苷類抗生素的極性實(shí)現(xiàn)LC-MS的分離和檢測(cè)[32]。

后來(lái)，隨著監(jiān)管部門(mén)對(duì)雜質(zhì)譜研究要求的提高，需要推定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)流動(dòng)相條件下檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)于中國(guó)藥典中的多氟酸流動(dòng)相，袁耀佐等[33]采用TFA-Fix技術(shù)，消除三氟乙酸對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的抑制，再后來(lái)有巧妙的通過(guò)直接在多氟酸流動(dòng)相添加微量丙酸的方法，在待測(cè)物質(zhì)色譜行為無(wú)明顯改變的前提下，實(shí)現(xiàn)將LC-ELSD的色譜條件直接應(yīng)用于LC-MS[34]，實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，這兩種方法對(duì)質(zhì)譜儀器污染嚴(yán)重，維護(hù)成本較高，且對(duì)儀器靈敏度等也有一定的影響，后來(lái)有報(bào)道[35]通過(guò)在質(zhì)譜前串接陰離子滲透膜，成功的在線去除流動(dòng)相中的多氟酸離子對(duì)試劑，實(shí)現(xiàn)LC-ELSD與LC-MS的無(wú)縫轉(zhuǎn)換，江蘇省食藥檢院在國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)過(guò)程也應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)成功地完成了奈替米星、核糖霉素及新霉素的雜質(zhì)譜研究工作。

但是對(duì)于烷基磺酸鈉類流動(dòng)相，其與LC-MS的無(wú)縫轉(zhuǎn)換技術(shù)還未見(jiàn)報(bào)道，有文獻(xiàn)報(bào)道[36]，采用最傳統(tǒng)的收集洗脫色譜峰，然后在另外的LC-MS系統(tǒng)中測(cè)定其質(zhì)譜信息的辦法，實(shí)現(xiàn)對(duì)歐洲藥典色譜條件下慶大霉素中檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)推定，這也可以理解為手動(dòng)的柱切換。

3.3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推定

表6 EMA抗生素有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制訂指導(dǎo)原則中對(duì)報(bào)告、鑒定和界定的閾值Tab.6 Reporting,identification and qualification thresholds in guideline on setting specifications for related impurities in antibiotics of EMA

圖6 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)推定基本線路圖Fig.6 Sketch paths of deduction of chemical structures of impurities

目前，推定雜質(zhì)檢出雜質(zhì)結(jié)構(gòu)思路基本如圖6所示，該思路也稱為“診斷碎片離子延伸推斷策略(diagnostic fragment ion based extension strategy)”[37]。該策略應(yīng)用的前提是通過(guò)對(duì)母體化合物及類似結(jié)構(gòu)已知雜質(zhì)的質(zhì)譜裂解途徑的分析，歸納出其裂解規(guī)律，然后按此規(guī)律，對(duì)未知雜質(zhì)的質(zhì)譜碎片離子可能的構(gòu)成進(jìn)行推測(cè)，進(jìn)而推定可能的結(jié)構(gòu)。對(duì)氨基糖苷抗生素質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究文獻(xiàn)很多[38-41]，對(duì)相關(guān)品種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的推定的文獻(xiàn)更多[42-51]，限于篇幅，本文不做具體展開(kāi)。另外，李正義等[52]還利用同樣的思路，綜合運(yùn)用1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC和HMBC一維和二維核磁共振技術(shù)，詳細(xì)對(duì)比研究了依替米星、1,3-二-N-乙基慶大霉素C1a和1,6'-二-N-乙基慶大霉素C1a的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，尤其是乙基所處不同氨基位點(diǎn)對(duì)于鄰近碳?xì)浠瘜W(xué)位移的影響，建立了一種快速、準(zhǔn)確分析氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)的方法。

3.4 雜質(zhì)制備及結(jié)構(gòu)確證

LC-MS主要用于雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的快速推定，但雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的最終確證，還是需要在獲得一定純度的雜質(zhì)后，通過(guò)多種波譜分析來(lái)確定，如王浩等[53]采用傳統(tǒng)的分離富集純化等手段，成功的鑒定了依替米星中部分雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。后來(lái)，李正義等[52]采用半制備型HPLC-ELSD法(柱后分流)的方法，制備了依替米星中的4種微量雜質(zhì)，采用NMR對(duì)他們的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確證。根據(jù)LC-MS推定的結(jié)構(gòu)信息，利用化學(xué)反向合成的辦法，是確證半合成氨基糖苷類抗生素雜質(zhì)的另一重途徑。蔣夢(mèng)虹等[54]采用類似的方法鑒定了卡那霉素中的4個(gè)雜質(zhì)。

4 展望

質(zhì)量控制水平的提升，受分析技術(shù)整體發(fā)展水平及人們對(duì)質(zhì)控理念變化的影響，對(duì)于氨基糖苷類抗生素也是如此。就具體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展而言，性狀描述會(huì)更嚴(yán)謹(jǐn)，不遠(yuǎn)的將來(lái)，有可能參考USP的做法，將性狀項(xiàng)目作為產(chǎn)品的參考消息列入標(biāo)準(zhǔn)，不再作為強(qiáng)制檢驗(yàn)項(xiàng)目；鑒別項(xiàng)下會(huì)更強(qiáng)調(diào)專屬，因此色譜技術(shù)應(yīng)該得到更加廣泛的接受；檢查項(xiàng)下，水分還是干燥失重的選擇以及具體的測(cè)定條件優(yōu)化應(yīng)該受到重視，方法會(huì)更為科學(xué)；有關(guān)物質(zhì)控制的TLC方法應(yīng)該逐漸被HPLC方法所代替，分離手段會(huì)以高柱效的硅膠基質(zhì)的反相色譜為主，也有可能被新的分離機(jī)制如HILIC等代替，檢測(cè)技術(shù)會(huì)以直接檢測(cè)為目標(biāo)，但選擇哪種方法會(huì)根據(jù)產(chǎn)品本身特點(diǎn)及質(zhì)控目標(biāo)進(jìn)行，流動(dòng)相的優(yōu)化建議借助相關(guān)的色譜優(yōu)化軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，在保證優(yōu)化質(zhì)量的前提下簡(jiǎn)化工作量。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在質(zhì)控過(guò)程中利用快速便捷的儀器分析方法替代繁瑣的抗生素微生物檢定效價(jià)法，采用含量替代生物效價(jià)(u/mg)作為質(zhì)控指標(biāo)將成為必然，為保證儀器分析替代抗生素效價(jià)測(cè)定的轉(zhuǎn)換過(guò)程中抗生素臨床劑量的連續(xù)性，明確抗生素中活性物質(zhì)的質(zhì)量(mg)與其效價(jià)單位(u)之間的量效關(guān)系成為關(guān)鍵。

總之，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，隨著人們對(duì)產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性認(rèn)識(shí)的逐漸深入，隨著標(biāo)準(zhǔn)全球化程度的提高，氨基糖苷類抗生素質(zhì)量控制水平會(huì)越來(lái)越高。

致謝：感謝陳瑤、馬迪和周丹等幫助收集整理相關(guān)資料。