盧明 陳代杰

(1 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 201203；2 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

氨基糖苷類抗生素是較早被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的一類抗生素。自1944年Waksman從灰色鏈霉菌中分離得到鏈霉素，大量氨基糖苷類抗生素相繼被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于細(xì)菌性感染的臨床治療[1]。鏈霉素發(fā)現(xiàn)近20年后，研究表明氨基糖苷類抗生素能夠抑制提前終止密碼子PTC(premature termination codon)的閱讀并恢復(fù)大腸埃希菌中的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)產(chǎn)生[2]。在人體中5%～70%的遺傳疾病是由框內(nèi)無義突變引起的，其在致病基因內(nèi)引入提前終止密碼子(PTC)。因此，在翻譯過程中形成了具有病理學(xué)意義的無功能或功能缺陷的截短蛋白。PTC抑制可以描述為一種以基因和疾病非依賴性方式治療突變的治療策略，該方法旨在抑制蛋白質(zhì)合成過程中核糖體的保真度，以便可以將共享PTC 3個(gè)核苷酸中2個(gè)核苷酸的近同源氨基tRNA插入肽鏈，從而繼續(xù)翻譯，并完整翻譯等長(zhǎng)度的功能蛋白[3]。因此，對(duì)許多遺傳性疾病的治療，抑制PTCs是一種可行的策略。

隨著RNA催化潛力的發(fā)現(xiàn)，許多氨基糖苷被報(bào)道與各種RNA分子相互作用并干擾其功能。其中除了原核蛋白翻譯抑制位點(diǎn)16S rRNA，還包括第一組內(nèi)含子自我剪接酶、RNase P和錘頭狀核酶[4]。此外，這些抗生素還通過干擾必要的RNA蛋白接觸抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)的復(fù)制[5-6]。在過去的幾年里，關(guān)于RNA結(jié)構(gòu)和功能的信息迅速增加，對(duì)RNA結(jié)合抗生素的作用模式有了更詳細(xì)的了解。本文將從氨基糖苷類抗生素作用機(jī)制及應(yīng)用兩方面綜述其拓展研究進(jìn)展。

1 氨基糖苷類抗生素作用機(jī)制

1.1 氨基糖苷類抗生素抑制PTCs的作用機(jī)制

氨基糖苷類抗生素是一類由單個(gè)或多個(gè)糖基取代的氨基環(huán)醇類化合物。其殺菌作用是通過與原核生物30S核糖體16S rRNA的A1408部位結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)譯，從而促使細(xì)菌細(xì)胞的死亡[7]。在真核生物的翻譯過程中(圖1)，同源氨基?；?tRNA(完全匹配的堿基對(duì))和近同源氨基酰基-tRNA(包含3個(gè)堿基對(duì)中的2個(gè))都可以與A位點(diǎn)相互作用。同源氨基?；? tRNA進(jìn)入A位點(diǎn)后，氨基酸添加到多肽鏈上后易位到P位點(diǎn)，空出A位點(diǎn)，從而允許下一個(gè)密碼子信使RNA序列的堿基配對(duì)和翻譯[8]。當(dāng)一個(gè)核糖體遇到一個(gè)終止密碼子的信使RNA序列，沒有同源氨基?；?tRNA可以與A位點(diǎn)序列堿基配對(duì)。此時(shí)，真核釋放因子eRF1和eRF3通過二者之間的相互作用促進(jìn)肽- trna的水解，并通過形成“終止復(fù)合物”來釋放新形成的多肽。eRF1識(shí)別并結(jié)合A位點(diǎn)的終止密碼子，改變了核糖體肽轉(zhuǎn)移酶的活性。eRF3以依賴于GTP的方式通過eRF1刺激肽的釋放[9-10]。

近同源的氨基?；?tRNA能夠與eRFs競(jìng)爭(zhēng)A位點(diǎn)上的終止密碼子的結(jié)合[11]。這導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸被整合到延長(zhǎng)的多肽鏈中，并將這種tRNA-肽鏈復(fù)合物轉(zhuǎn)移到P位點(diǎn)，有效地允許終止密碼子的“通讀”。每個(gè)終止密碼子都可以通過使用一組特定的近同源氨基酸進(jìn)行無義抑制來翻譯(圖1)。正常情況下，人體內(nèi)PTCs的通讀概率＜1%，自然終止密碼子的抑制概率＜0.1%[12]。無義突變的基礎(chǔ)水平過低，無法恢復(fù)功能，但功能蛋白的進(jìn)一步增加可能緩解疾病[13]。多種氨基糖苷類藥物在體內(nèi)外及多種組織和疾病模型中均已表現(xiàn)出無義抑制活性，包括慶大霉素、帕洛霉素、G418、鏈霉素、利維霉素、妥布霉素等，通過增加PTCs通讀恢復(fù)少量的功能活性蛋白，在緩解多種遺傳疾病方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[14-17]。在氨基糖苷介導(dǎo)的無義抑制過程中，通讀效率與誘導(dǎo)A位點(diǎn)結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系尚不完全清楚。目前上述氨基糖苷類抗生素中，G418、慶大霉素和帕洛霉素具有最廣泛和最有效的PTC通讀活性[19-21]。PTCs通讀效能不僅因基因而異，還取決于相關(guān)基因中終止密碼子的類型和位置以及周圍的mRNA序列。一些終止密碼子比其他密碼子更容易被通讀，盡管有一項(xiàng)研究表明終止密碼子的類型和慶大霉素治療效果之間沒有相關(guān)性，但對(duì)于UGA＞UAG＞UAA的偏愛確已被報(bào)道[11,22]。

1.2 氨基糖苷類抗生素抑制RNA酶作用機(jī)制

氨基糖苷類抗生素由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成，是具有高度柔韌性的多電荷化合物。RNA鏈上的負(fù)電荷與氨基糖苷上的正電荷結(jié)合，從而有助于將其容納在RNA螺旋內(nèi)部環(huán)內(nèi)的結(jié)合袋中或核酶核心中，以進(jìn)行特定的接觸。研究發(fā)現(xiàn)，核酶中存在兩種類型的氨基糖苷結(jié)合位點(diǎn)：第一種由不對(duì)稱內(nèi)部環(huán)組成，如HIV的RRE和Tar結(jié)構(gòu)域中的解碼位點(diǎn)[23-24]。第二種結(jié)合位點(diǎn)是核酶催化核心中的金屬離子結(jié)合口袋[25]。在I型結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，作用方式可能是通過RNA結(jié)構(gòu)的輕微扭曲和干擾功能性底物的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的，而在II型結(jié)合位點(diǎn)中，氨基糖苷類則通過置換必要的二價(jià)金屬離子起作用。核糖核酸酶P(核糖核酸酶P)是一種依賴Mg2+的核糖核酸內(nèi)切酶，負(fù)責(zé)tRNA前體5'端加工。在Mikkelsen等[26]研究發(fā)現(xiàn)RNase P在有或無RNase P蛋白時(shí)均可被幾種氨基糖苷類抑制。

在過去的幾十年中，氨基糖苷類抗生素對(duì)抗HIV-1的功效已經(jīng)被廣泛證明。HIV-1基因表達(dá)是由Tat激活的，Tat是一種病毒編碼的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，它與一種稱為TAR的病毒RNA序列相互作用，位于所有病毒mRNA的5-末端。Lapidot等[27]基于HIV-1 RNA結(jié)合的肽模型，基于Tat反應(yīng)元件-配體復(fù)合物和氨基糖苷- RNA相互作用的NMR結(jié)構(gòu)，以及HIV-1 Tat結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了氨基糖苷-精氨酸偶聯(lián)物(AACs)和氨基糖苷多精氨酸偶聯(lián)物(APACs)作為Tat的模擬物，這些化合物通過與HIV-1 Tat反應(yīng)元件(TAR)RNA和HIV-1 Rev反應(yīng)元件(RRE)RNA相互作用調(diào)節(jié)RNA參與病毒生命周期的各個(gè)階段。除了作為Tat拮抗劑，它們還可以通過阻斷HIV-1細(xì)胞進(jìn)入的幾個(gè)步驟來抑制HIV-1的感染性。AACs和APACs通過在cd4結(jié)合位點(diǎn)與gp120相互作用，通過在CXCR4 mAb 12G5結(jié)合位點(diǎn)與CXCR4相互作用，以及通過與gp41外區(qū)瞬時(shí)結(jié)構(gòu)相互作用抑制HIV-1細(xì)胞的進(jìn)入(圖1)[27-30]。

2 氨基糖苷類抗生素的拓展應(yīng)用

2.1 氨基糖苷類抗生素抑制PTCs的應(yīng)用研究

圖1 蛋白質(zhì)翻譯和氨基糖類抗生素(AGs)作為無義抑制劑的作用機(jī)制Fig.1 The mechanism of protein translation and aminoglycoside antibiotics as nonsense inhibitors

框內(nèi)無義突變引起的遺傳性疾病，主要包括囊性纖維化(CF)[31]，Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)[32]，Usher綜合癥(USH)[33]以及Hurler綜合征(HS)，其分別涉及CFTR、dystrophin、PCDH15和IDUA蛋白基因的突變，導(dǎo)致翻譯過早終止并最終形成錯(cuò)誤截短的非功能性蛋白質(zhì)(表1)。氨基糖苷類抗生素能夠抑制提前終止密碼子PTC的閱讀并恢復(fù)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的翻譯。

目前國(guó)外主要用于慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊性纖維化患者和非CF性慢性支氣管擴(kuò)張患者的藥物有妥布霉素吸入溶液(國(guó)外已批準(zhǔn)上市)、阿米卡星注射液和慶大霉素注射液。Du等[32]研究發(fā)現(xiàn)慶大霉素可以部分恢復(fù)DMD和CF[31]小鼠模型中功能蛋白的表達(dá)。CFTR蛋白的合成從正常水平的＜1%增加至5%，這可能會(huì)大大降低CF疾病的嚴(yán)重性[34-35]。2017年2月13日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了Vertex醫(yī)藥公司的Symdeko(tezacaftor/ivacaftor+ivacaftor)上市，用于治療12歲及以上的囊性纖維化患者。這也是Vertex獲得FDA批準(zhǔn)的第3種針對(duì)囊性纖維化根本病因的治療藥物。Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥發(fā)病機(jī)制主要為編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因DMD的無義突變過早地停止了抗肌萎縮蛋白的翻譯，由此導(dǎo)致的紊亂使得蛋白質(zhì)不能全部表達(dá)而不再起作用。Translana(Ataluren或PTC-124，CFTR-G542X 無義等位基因抑制劑)是歐洲藥品管理局(EMA)于2014年7月31日批準(zhǔn)的蛋白表達(dá)修復(fù)新藥，靶向致病基因編碼蛋白，通過促進(jìn)核糖體通讀來治療，允許繞過致病變異體并繼續(xù)翻譯過程以產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)[36]。

表1 氨基糖苷類抗生素的應(yīng)用Tab.1 Application of aminoglycoside antibiotics

自1957年Schuknecht[37]首先提出氨基糖苷類抗生素治療梅尼埃病并逐漸用于臨床，其治療效果也逐漸得到肯定。雙盲隨機(jī)對(duì)照的前瞻性研究以及循證醫(yī)學(xué)研究均已經(jīng)證實(shí)了鼓室注射慶大霉素對(duì)梅尼埃病患者眩暈控制的有效性[38]。Watson等[39]分析認(rèn)為鼓室內(nèi)注射低劑量的慶大霉素治療對(duì)控制梅尼埃病患者的癥狀有效，同時(shí)可以保留聽力。Pullens等研究發(fā)現(xiàn)，在雙盲、安慰劑對(duì)照的關(guān)于鼓室內(nèi)慶大霉素對(duì)眩暈癥狀影響的隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，與安慰劑組相比，這兩項(xiàng)試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)慶大霉素組的眩暈癥狀明顯減少。鼓室注射慶大霉素(ITG)可能是根除梅尼埃病患者眩暈最有效的非手術(shù)治療，但也是具有不可忽視的聽力損失風(fēng)險(xiǎn)的破壞性治療方法。ICON推薦對(duì)側(cè)前庭功能良好的患者在聽力受損時(shí)優(yōu)先使用ITG作為破壞性治療方法[40]。

Usher綜合征是一種常染色體隱性遺傳病，患者先天性、雙側(cè)性耳聾，伴有視網(wǎng)膜色素變性(RP)引起的視力損害。迄今已經(jīng)鑒定出14個(gè)與user綜合征相關(guān)的致病基因，包括MYO7A、USH1C、USH1G、CDH23和PCDH15等。29%～50%的USH1型是由MYO7A表達(dá)不正常引起的。該基因含有49個(gè)外顯子，編碼2215個(gè)氨基酸。c.4513G＞ T (p.Glu1505Ter)突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)截短，激活無義介導(dǎo)的衰敗(NMD)途徑。目前已經(jīng)開始使用TranslarnaTM(也稱為ataluren或PTC124)進(jìn)行無虹膜的試驗(yàn)(NCT02647359)。同樣，賀勒氏癥主要由編碼α-L-艾杜糖醛縮酶(IDUA)的基因突變導(dǎo)致的，酶替代療法(ERT)目前正在使用或正在測(cè)試中。Aldurazyme是首個(gè)用于治療包括Hurler綜合征在內(nèi)的黏多糖貯積癥I(MPS-I)的生物制劑。Wang等[41]利用重組腺病毒相關(guān)載體，通過Cas9/sgRNA系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯。

盡管氨基糖苷類抗生素已顯示出對(duì)PTCs抑制治療應(yīng)用具有相當(dāng)大的潛力，但實(shí)際應(yīng)用過程中仍然存在一些問題。氨基糖苷類(如慶大霉素)不易溶于脂質(zhì)，全身給藥時(shí)難以穿透細(xì)胞[42]。最值得注意的是，這些藥物仍難以穿過血視網(wǎng)膜或血腦屏障，有效全身性輸送至視網(wǎng)膜或腦脊液的挑戰(zhàn)仍然存在。目前已經(jīng)在嘗試?yán)弥|(zhì)體包囊氨基糖苷以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)遞送，以期通過增加藥物向細(xì)胞質(zhì)的遞送來優(yōu)化治療效果[43]。2009年，Nudelman等[19]報(bào)道了與慶大霉素相比，新型氨基糖苷類衍生物(NB54)的開發(fā)具有更好的通讀效率和更低的毒性。該化合物在體外模擬針對(duì)具有引起疾病的無義突變的基因的DNA片段進(jìn)行測(cè)試。NB54表現(xiàn)出針對(duì)DMD、HS以及CF等病癥有關(guān)的基因的增強(qiáng)的PTC抑制能力。Nudelman等的研究基于優(yōu)化藥物潛在的抑制功效和毒性，為開發(fā)氨基糖苷的新型結(jié)構(gòu)提供了新的方向。而在這個(gè)方向上的進(jìn)一步發(fā)展可能為治療由無義突變引起的許多遺傳疾病提供更多的可能性。

2.2 氨基糖苷類抗生素抑制RNA酶的應(yīng)用研究

除了干擾遺傳密碼的翻譯外，氨基糖苷類抗生素在體外還能抑制幾種核酶的活性。第一組內(nèi)含子自剪接[44]、錘頭狀核酶自剪接[45]、人類肝炎病毒(HDV)核糖酶[46]、發(fā)夾狀核酶Mg2+誘導(dǎo)的自我剪接[47]以及RNase P RNA的tRNA加工活性[48]都可被相同的氨基糖苷類抑制，最顯著的是新霉素B和妥布霉素。關(guān)于錘頭狀核酶的抑制，研究發(fā)現(xiàn)新霉素B至少與一個(gè)Mg2+競(jìng)爭(zhēng)，且抑制效率依賴于pH值，即與抗生素的質(zhì)子化氨基相關(guān)[49]。在沒有金屬離子的情況下，氨基糖苷類抗生素還可以促進(jìn)發(fā)夾狀核酶的裂解反應(yīng)。發(fā)夾狀核酶不依賴于二價(jià)金屬離子進(jìn)行催化，但Mg2+會(huì)極大地促進(jìn)其折疊。新霉素B可以替代折疊所需的Mg2+，因此可以強(qiáng)烈刺激核酶的活性[47,50]。這與新霉素B對(duì)錘頭狀核酶的作用相反，后者通過從催化核心置換必需的Mg2+而被抗生素抑制。但Chia等[51]也發(fā)現(xiàn)HDV的核酶在體內(nèi)對(duì)氨基糖苷不敏感，盡管該核酶在體外是敏感的。

2018年11月，雷鳴團(tuán)隊(duì)成功解析了酵母內(nèi)源RNase P全酶及其與底物pre-tRNA的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)RNase P以一種“雙錨定(double anchor)”的機(jī)制來識(shí)別tRNA前體。tRNA的5'端被特異的錨定在催化中心以促使其完成切割反應(yīng)。底物tRNA的結(jié)合誘導(dǎo)了該酶催化中心一個(gè)關(guān)鍵殘基的巨大的構(gòu)象變化。結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬，他們提出了RNase P催化反應(yīng)的雙鎂離子模型[52]。新霉素B的結(jié)合會(huì)干擾二價(jià)金屬離子進(jìn)入RNA。綜上可知，氨基糖苷與Mg2+離子競(jìng)爭(zhēng)重要的二價(jià)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。因此，RNase P作為一種重要的酶，是一種潛在的藥物靶點(diǎn)，可作為多種氨基糖苷類先導(dǎo)化合物開發(fā)新藥。

Lapidot等[27]基于HIV-1 RNA結(jié)合的肽模型，設(shè)計(jì)合成了氨基糖苷-精氨酸偶聯(lián)物(AACs)和氨基糖苷多精氨酸偶聯(lián)物(APACs)作為Tat的模擬物。這些化合物分子靶向HIV-1 TAR或RRE，在較低的微摩爾范圍內(nèi)以50%的有效濃度抑制HIV-1的病毒復(fù)制，最有效的化合物是六精氨酸-新霉素B和九烷基-精氨酸-新霉素偶聯(lián)物。它們除了充當(dāng)Tat拮抗劑外，還通過阻止HIV-1細(xì)胞進(jìn)入的幾個(gè)步驟來抑制HIV-1感染性。用同一種化合物針對(duì)病毒生命周期中的幾個(gè)關(guān)鍵過程不僅可能提高其抗病毒功效，更重要的是，可能降低病毒對(duì)該化合物產(chǎn)生耐藥性的能力。因此，AACs和APACs可能成為開發(fā)多靶點(diǎn)新型HIV-1抑制劑的先導(dǎo)化合物。

目前，人們已經(jīng)通過不同的方法，包括組合合成、高通量篩選和對(duì)現(xiàn)有氨基糖苷類藥物的化學(xué)修飾等，來解決分離對(duì)獨(dú)特RNA基序特異性增強(qiáng)和對(duì)細(xì)胞毒性降低的新藥物的障礙[53-54]。通過化學(xué)修飾增加氨基糖苷的電荷和降低它們的堿度，可以增加它們對(duì)目標(biāo)RNA的親和力[55]。氨基糖苷的二聚體也可以增強(qiáng)對(duì)錘頭狀核酶的結(jié)合親和力[56]。所有這些新技術(shù)最終將有助于更好地理解抗生素與靶標(biāo)之間的相互作用，從而在已有抗生素的基礎(chǔ)上開發(fā)出更高效低毒的抗生素。